实验手册(钱平课题组).docVIP

华中农业大学农业微生物学国家重点实验室 动物病原分室 实 验 手 册 (钱平课题组)目录 实验一 感受态细胞的制备 一、CaCl2法制备感受态细胞 主要仪器设备 生物安全操作台（细菌实验用）：哈尔滨东联 低温离心机： 37 ℃温箱 主要试剂 0.1 mol/L CaCl2：27g CaCl2.6H2O溶于1000 mL双蒸水中，过滤除菌，-4℃保存备用或常温保存，使用前置于冰上预冷。 LB液体培养基： LB平板: 操作步骤 用无菌接种环取冻存的菌种DH5(于LB平板上划线，同时在含氨苄青霉素（Amp）的LB平板上划线做对照，37 ℃温箱培养过夜。次日挑取生长良好的单个菌落于5 (L LB液体培养基中37℃振摇过夜。取1 mL活化后的培养液加到100 mL LB液体培养基中，37℃剧烈振摇培养2.5－3.0 h，使OD600值达到0.5。 在无菌条件下将细菌培养物倒入灭菌后用冰预冷的50ml离心管中，于4 ℃ 5500 rpm离心8 min，弃上清，回收菌体细胞。 用10ml冰预冷的0.1 mol/L CaCl2温和悬起细菌沉淀，于4 ℃ 5500 rpm离心8 min，弃上清，回收菌体细胞。 用10 mL冰预冷的0.1 mol/L CaCl2温和悬起细菌沉淀，冰浴放置30 min。 于4 ℃ 4500 rpm离心10 min，弃上清，用1.0 mL冰预冷的0.1 mol/L CaCl2温和悬起细菌沉淀。 加入终浓度为15%的灭菌甘油，混匀后分装为100 (L/管，直接用于转化或置于-70 ℃冰箱中保存备用。 备注： 1．CaCl2可以用0.2(m孔径的滤器过滤（最好），或者高压灭菌。 2．离心管最好用新的，旧的离心管要彻底的洗干净，千万不要留有洗涤剂等残留物。 3．冰浴后的细菌操作要轻。 4．低温操作（保持在冰上）。 二、电转化感受态细胞的制备（Preparation of Electrocompetent E.coli (i.e. DH5а)）(Revised 2/24/96) 主要仪器设备：同上。 主要试剂： LB media (1.0L) (no antibiotics!), store at RT. chilled autoclaved dH2O (1.0L), stored in 4℃ cold room. chilled 10% glycerol / dH2O solution (100ml), store at 4℃. Coring 250ml pointed bottles (w/ orange caps) with white adapters chilled at 4℃. (using in Beckman tabletop GPR with GH-3.7 rotor, church 64) Rinse bottles first with 95% EtOH, then really well with dH20. No soap! 操作步骤 Preferably, select single colony of E.coli from fresh LB plate for inoculating a 10 ml LB overnight (O/N) starter culture. Alternatively, streak out frozen glycerol stock of bacterial cells onto LB plate, grow plate O/N, and then select single colony for starter culture. Grow 10 ml starter culture O/N in 37℃ shaker (250rpm). Inoculate 1L of LB media and place culture in 37℃ shaker. Grow cells and measure OD600 every 45min-1hr. When the OD600 equals 0.6-0.9 (log phase growth), remove the cells from the shaker and place on ice. NOTE:IT IS VERY IMPORTANT TO KEEP THE CELLS AT 4℃ (OR ON ICE) FOR THE REMAINDER OF PROCEDURE. Split the 1L culture into four equal parts by pouring ~250ml of culture into each chilled 250 ml Cornin