中学教育动物生物化学实验讲义.docVIP

实 验 讲 义 （霍金龙老师） 实验一 实验基本知识与基本操作，血液样品的处理及组织匀浆的制备 实验二 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量 实验三 琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制的观察 实验四 血液葡萄糖的测定（福林—吴宪氏法）（紫外吸收法）全血基因组DNA的提取（离心柱型试剂盒提取法）PCR扩增基因实验二 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量 一、原理 蛋白质的存在影响酸碱滴定中某些指示剂的颜色变化，即改变这些染料的光吸收。在此基础上发展了蛋白质染色测定方法。可用的指示剂有甲基橙、考马斯亮蓝、溴甲酚绿和溴甲酚紫。目前广泛使用的染料是考马斯亮蓝。 考马斯亮蓝G-250在酸性溶液中为棕红色，当它与蛋白质通过范德华键结合后，变为蓝色，且在蛋白质一定浓度范围内符合比尔定律，可在595 nm波长处比色测定。2~5即呈最大光吸收，至少稳定1小时。10~100 μg/ml蛋白质范围内均可。该法操作简便迅速，消耗样品量少，但不同蛋白质之间差异大，且标准曲线线性较差。高浓度的Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸铵和去污剂等对测定有干扰。缓冲液浓度过高时，改变测定液pH值会影响显色。考马斯亮蓝染色能力强，比色杯不洗干净会影响光吸收值，不可用石英杯测定。 二、试剂及器材 1．染色液：取考马斯亮蓝G-250 100 mg溶于50 ml 95%乙醇中，加入100 ml 85%磷酸，加双蒸水稀释至1 L。该染色液可保存数月，若不加水可长期保存，用前稀释。 2．标准蛋白溶液：结晶牛血清白蛋白bovine serum albumin, BSA）用蒸馏水配制成1 mg/ml浓度。 3．样品：经100倍稀释的牛奶。 三、操作 1．蛋白质标准曲线的绘制 管 号 试剂 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12（待测样品） 标准蛋白(μl) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 待测样品100 双蒸水(μl) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 染色液(ml) 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 取1支试管编号，按下表加入试剂。 混匀，5 min后测定各管OD595，并以蛋白浓度为横坐标，OD595值为纵坐标，绘制标准曲线。 样品测定：100倍稀释牛奶，并于1支干净试管中加入适当量（100 μl），按上法测OD值，对照蛋白质浓度标准曲线，求得蛋白含量，再乘以牛奶稀释倍数，即得原样品浓度。并将之换算为百分浓度。 四、思考题 1．考马斯亮蓝染色测定蛋白质含量的方法有哪些优缺点？ ．采用分光光度法测定某一样品含量时，为什么有时需对样品做稀释？使用的玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇冲洗，以洗去颜色。 1. 开机前的检查：开机前打开样品室盖，检查样品室内是否有物品挡在光路上。 光路上有阻挡物将影响仪器的自检，甚至造成仪器故障。 2. 预热：接通仪器电源，预热20～30 min后，用波长选择旋钮设置测试所需波长。 3. 调零：将空白溶液与待测溶液分别倒入比色皿中，把盛有溶液的比色皿放入比色架中（注意比色皿的光面和毛面不要放反），盖上样品室盖，使空白溶液对准光路，用〈MODE〉键选择“T”测试方式，按“100%”键调节光度计读数为“100.0”。用〈MODE〉键选择“A”测试方式，看光度计读数是否为“0.000”。则可以开始测定待测溶液的吸光度值。 按mode键，指示灯在T、A、C、F之间跳动（如下表），当指示灯亮点跳到T键，按100，显示“8LR”时，等待，显示100时，按A键，此时吸光度值显示为0。 ● Transmittance ● Transmittance ● Absorbance ● Absorbance ● Concentration ● Concentration ● Factor ● Factor 4. 测定：轻轻拉或推动比色架固定拉杆，使第二个比色皿溶液处在光路中，此时读数即为该溶液的吸光度。（空白管放在靠近测试者一边用拉的方法，且拉杆全部推入仪器内调零；空白管放在远离测试者一边用推的方法，拉杆全部拉出来后调零） 5. 依次拉或推出第三，第四个比色皿，分别读取溶液的吸光度值。 6. 测定完毕，先打开样品室盖，再关闭电源。将比色皿取出洗净，并将比色皿座架及暗箱用软纸擦净。 每次都用“0号”做空白对照，即0号管不用动，每次测3管，每测完3管开盖后再测要重新调零，组内测定可以不用洗比色杯，最好先测低浓度，后测高浓度，否则影响实验结果。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12（待测样品） 浓度mg/mL) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.