SOD_CAT及POD活性的测定.docVIP

测定方法 一．SOD，CAT及POD活性的测定 分别取0.4ｇ材料于预冷的研钵中，加入8 ml预冷的50 mmol-1磷酸缓冲液（pH 7.8）（先加2ml, 在冰浴下研磨成匀浆后，将匀浆转入10ml离心管，再用6ml冲洗），10000 rpm离心15 min，取上清液定容至10ml后于4℃保存。上清液用于可溶性蛋白质含量、SOD活性及POD活性的测定。 SOD活性测定.显色反应 取5mL指形管（要求透明度好）4支，2支为测定管，另2支为对照管，按表47–1加入各溶液。 混匀后，给1支对照管照上比试管稍长的双层黑色硬纸套遮光，与其他各管同时置于4000lx日光灯下反应min 要求各管照光情况一致，反应温度控制在25～35℃之间，使酶活性高低适当调整反应时间 。 当样品数量较大时，可在临用前根据用量将表47–1中各试剂 酶液和核黄素除外 按比例混合后一次加入2.65mL，然后依次加入核黄素和酶液，使终浓度不变。 表 47-1 各溶液显色反应用量 用量 mL 终浓度 比色时 0.05mol/L磷酸缓冲液 1.5 130mmol/LMet溶液 0.3 13mmol/L 750μmol/LNBT溶液 0.3 75μmol/L 100μmol/L EDTA-Na2液 0.3 10μmol/L 20μmol/L核黄素 0.3 2.0μmol/L 酶液 0.1 2支对照管以缓冲液代替酶液 蒸馏水 0.5 总体积 3.3 3.SOD活性测定 至反应结束后，用黑布罩盖上试管，终止反应。以遮光的对照管作为空白，分别在560nm下测定各管的OD值，计算SOD活性。 已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD活性。 式中：SOD总活性以酶单位每克鲜重表示。 比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示。 ACK ——照光对照管的吸光度。 AE ——样品管的吸光度。 VT ——样品液总体积，mL。 V1 ——测定时样品用量，mL。 W——样品鲜重，g。 蛋白质含量单位为mg/g。 取两支试管，洗涤后甩干水分。 试剂 管号（对照） 测定管 0.05mol/L PH 5.5的磷酸缓冲液 2.9ml 2.9 ml 2%双氧水溶液 0 ml 1.0 ml 0.05mol/L愈创木酚溶液 1.0 ml 1.0 ml 蒸馏水 3.0 ml 2.0 ml 总体积 7.0 ml 7.0 ml 　　将上述各管立即放入预先调好37 的水浴锅中保温5min以上（酶促反应），向对照管中加入0.1 ml酶液，混匀，在λ470 nm处调零，再向测定管中加入0.1 ml酶液，并且立即计时，混匀后进行比色测定，3分钟时立即读取吸光度。（也可以每分钟读取一次，3分钟内吸光度变化值ΔA ） △A470 × 酶提取液总量（ml） 酶活性（△A470·g－1Fw·min－1） ——————————————————— 样品鲜重（g）× 测定时酶液用量（ml） 过氧化氢酶的活性测定——紫外吸收法 【原理】 H2O2在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度 A240 随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。 【仪器与用具】 紫外分光光度计；离心机；研钵；250ml容量瓶1个；0.5ml刻度吸管2支，2ml刻度吸管1支；10ml试管3支；恒温水浴； 【试剂】 0.2mol/L pH7.8磷酸缓冲液（内含1%聚乙烯吡咯烷酮）； 0.1mol/L H2O2（用0.1mol/L高锰酸钾标定）。 【方法】 1.酶液提取：称取新鲜小麦叶片或其它植物组织0.5g置研钵中，加入2～3ml 4℃下预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入25ml容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。混合均匀将量瓶置5℃冰箱中静置10min，取上部澄清液在4000rpm下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液。5℃下保存备用。 2.测定：取10ml试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管，按表40-2顺序加入试剂。 表40-2 紫外吸收法测定H2O2样品液配置表 管 号 S1 S2 S3 粗酶液 ml 0.2 0.2 0.2 pH7.8磷酸 ml 1.5 1.5 1.5 蒸馏水 ml 1.0 1.0 1.0 25℃预热后,逐管加入0.3ml 0.1mol/L的H2O2，每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比色杯中，240nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测4min，待3支管全部测定完后，按下式计算酶活性。 3.结果计算： 以1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位（u）。 过氧化氢酶活性 u/gFW/min