2-酶谱法检测清基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9的活性.pptVIP

第二部分，酶谱法检测血清中基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的活性 * 酶谱法检测血清中基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9活性 综合性设计性实验-2 此实验共包括如下三个部分 第一部分，电泳技术简介 第二部分，酶谱法检测血清中基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的活性 第三部分，食管癌患者血液中MMP-2和MMP-9的活性变化及其临床意义 第一部分，电泳技术简介 电泳：带电粒子在电场中的定向移动。 由于混合物各组分所带电荷性质、数量以及分子量各不相同，在同一电场作用下，各组分的泳动方向和速度也各有差异，所以在一定时间内，它们移动距离不同，从而可达到分离鉴定的目的。 影响泳动率u的因素 内因：1.净电荷：电荷愈多愈快 2.粒子大小：颗粒直径愈小愈快 3.粒子形状：愈接近球形愈快 外因：1.V ( U/L)：电场强度越高电泳速度越快 2.缓冲液的pH (pH恒定)： PH值决定带电颗粒的解离程度，决定物质所带净电荷的多少 3.离子强度[I] 最适:0.02-0.2 缓冲液的离子强度越高，电泳速度越慢 4.电渗：液体对固体支持物的相对移动，应尽量避免选用有电渗作用的支持物 按支持介质的不同可分为：纸电泳（Paper electrophorisis）醋酸纤维薄膜电泳（Cellulose Acetate electrophoresis）琼脂凝胶电泳（Agar Gel electrophoresis） 聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide Gel-electrophoresis） SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法） 按支持介质形状不同可它为： 薄层电泳 板电泳 柱电泳 电泳设备 垂直电泳系统 水平电泳系统 聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N,N′-甲叉双丙烯酰胺(N,N ′ -methylene-bisacylamide,简称Bis)在加速剂 N,N,N,N-四甲基乙二胺(N,N,N,N-tetram-ethyl ethylenedia mine，简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(ammonium persulfate (NH4)2S2O3，简称AP) 的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)。 N,N′-甲叉（亚甲基）双丙烯酰胺 催化剂 丙烯酰胺 聚丙烯酰胺 聚丙烯酰胺凝胶有下列特性： 在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好； 化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶； 对pH和温度变化较稳定； 几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好； 样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g； 凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径； 分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。 SDS－PAGE的原理 聚丙烯酰胺凝胶电泳是网状结构，具有分子筛效应，蛋白质在电泳中保持完整的状态，蛋白在其中依三种因素分开：蛋白大小，形状和电荷。 而SDS仅根据蛋白分子量亚基的不同而分离蛋白。这个技术首先是1967年由shapiro建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，电荷因素可以忽视。 SDS（Sodium Dodecyl Sulfate）是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使绊胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的蛋白量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。 因此在电泳时，蛋白质分子的迁移速度则主要取决于蛋白质分子大小。 不同分子量的蛋白质在凝胶中运动示意图 不同聚丙烯酰胺凝胶浓度对不同分子量的 蛋白质混合物分离能力的关系 5％ 10％ 15％ 29 45 66 97 200 29 45 66 97 200 29 45 66 97 200 肿瘤细胞的侵袭移动 C B A D