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全基因组扩增?——微量DNA分析的金钥匙 来源：青年人(Qnr.Cn)?更新时间：2010/3/8 19:51:27 ?【字体： HYPERLINK javascript:fontZoomA(); 小 HYPERLINK javascript:fontZoomB(); 大】 　聚合酶链反应(PCR)技术的发展和应用使得微量甚至单个细胞DNA的分析成为可能，极大地促进了法医学、古生物学、分子诊断学和分子病理学的发展。但即便是对于非常敏感的PCR技术，许多材料所能提供的DNA量也只能用于一次或几次PCR反应。为能从少量细胞中最大限度的获取信息，全基因组扩增技术应运而生。　　一、全基因组扩增的概念　　全基因组扩增（whole genome amplification, WGA）是一组对全部基因组序列进行非选择性扩增的技术，其目的是在没有序列倾向性的前提下大幅度增加DNA的总量。常用的方法有IRS-PCR（interspersed repeat sequence PCR）［1］、LA-PCR（linker adaptor PCR）［2］、T-PCR（Tagged-PCR）［3］、DOP-PCR（degenerate oligonucleotide primed PCR）［4］、PEP-PCR（primer extension preamplification PCR）［5］等。其中最具代表性方法是DOP-PCR和PEP-PCR。　　DOP-PCR和PEP-PCR的基本原理都是通过其随机引物与基因组DNA多处退火从而使大部分基因组序列得到扩增。DOP-PCR的引物是由其3′和5′端的特异核苷酸序列和中间的6个核苷酸构成的随机引物组成。其PCR程序是先在低退火温度下进行几个循环的低严谨扩增，然后再提高退火温度，进行几十个循环的严谨扩增。由于DOP-PCR的引物3′端设计的是在基因组中高频出现的序列，因此，在首轮的低严谨扩增条件下能与基因组多处退火，从而将基因组普遍扩增。然后下一轮的严谨扩增中又将低严谨扩增的产物再次放大［4］。与DOP-PCR不同的是，PEP-PCR的引物是由15个随机核苷酸组成的完全随机引物。PCR由50个循环组成，每个循环的退火温度都是由37℃连续升温至55℃，从而确保不同组成的引物与尽可能多的基因组序列退火，使整个基因组得到放大［5］。　　二、全基因组扩增的质量控制　　全基因组扩增的主要目的是在如实反映基因组原貌的基础上最大限度地增加DNA量。因此，扩增效率和保真性是衡量全基因组扩增技术优劣的主要标准，此外，扩增片段的大小对于序列较长的基因片段分析来讲也是一个重要因素。　　（一）扩增效率　　DOP-PCR和PEP-PCR均能较大幅度地扩增模板DNA的量。据Cheung等［6］报道，DOP-PCR可将原模板扩大12至2万倍，而且，模板量越少，扩增倍数越高，这主要是由于受到DNA聚合酶和引物量的限制。PEP-PCR的精确定量研究尚未见报道，但就Zhang等［5］的保守估计，一个单一基因组拷贝的精子在PEP-PCR后至少有78%的基因组序列可以扩增30倍以上。也有人报道，PEP-PCR的扩增效率可以在1 000倍以上［7］。不同的模板扩增效率差别很大，一般说来，新鲜完整的细胞，如体外培养的细胞、外周血淋巴细胞等扩增效率最高，而组织切片，特别是经甲醛溶液固定的石蜡切片DNA扩增效率最低［8］,可能是由于在切割制片及后续处理中DNA受损质量下降所致。但即便如此，其扩增效率仍然非常可观。Duddy等［9］报道，3 μm的石蜡切片上1 mm2的细胞经PEP-PCR扩增后，可进行10～100个位点的分析。　　与特异位点PCR不同，DOP-PCR和PEP-PCR的引物在整个基因组上有多个退火位点，因此相同量的引物和DNA聚合酶在前几个循环内便达到饱和而进入线性增长期，因此全基因组扩增效率的主要限制因素是DNA聚合酶和引物的量［4，10］。实验也证明，在一定范围内增加引物和DNA聚合酶的量可以提高扩增效率，但过高的引物和酶量会由于引物自连形成过多非模板相关序列［4］。WGA和后续的PCR循环数较多，时间较长，这对于DNA聚合酶的耐热性和保真性是一个考验。已有人用比Taq酶耐热性和保真性更好的DNA聚合酶Vent进行WGA［7］，也有人证明用高保真聚合酶能提高WGA的产率［8］，可能是由于后者的3′～5′的DNA外切酶活性可以校正在低严谨条件下不完全匹配的引物3′端，使之延伸更有效。另外，Dietmaier等［8］认为，细胞的裂解法对于WGA的扩增效率也有影响。　　PEP-PCR和DOP-PCR相比较，DOP-PCR扩增效率可能高于PEP-PCR，Wells等［11］用琼脂糖凝胶电泳EB染色的方法可以在紫外光下看到D