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植物保护研究方法 实时荧光定量PCR技术及其在昆虫学研究中的应用 实时荧光定量PCR技术及其在昆虫学研究中的应用 实时荧光定量PCR( real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction, FQ-PCR)是一种利用荧光信号实时监测体外 DNA 分子 PCR 复制过程中每个循环的扩增产物, 从而实现对 DNA 模板进行定量分析的技术, 具有准确、快速、灵敏、特异等优点, 在动植物基因工程、动植物检疫、微生物鉴定与分类、食品安全检测和医学等领域中得到广泛应用。 1 实时荧光定量PCR的原理实时荧光 PCR 均是基于荧光共振能量转移( fluorescence resonance energy transfer, FRET)原理, 即当一个荧光基团与一个荧光淬灭基团的距离邻近至一定范围时, 就会发生荧光能量转移, 淬灭基团会吸收荧光基团在激发光作用下的激发荧光,从而使其发不出荧光;荧光基团一旦与淬灭基团分开, 淬灭作用即消失。因此, 可以利用FRET ,选择合适的荧光基团和淬灭基团对核酸探针或引物进行标记 ,利用核酸杂交和核酸水解所致荧光基团和淬灭基团结合或分开的原理, 建立各种实时荧光PCR方法2 实时荧光定量PCR技术在昆虫学研究中的应用 2.1在昆虫基础生物学研究中的应用 家蝇是100多种人和动物疾病病原物的载体,与人类的生活和健康密切相关,全面了解家蝇基因组DNA序列组成是控制家蝇、预防疾病的基础。Gao和Scott通过SYBR GreenⅠ对家蝇单拷贝基因Cyp6d1和黑腹果蝇单拷贝基因Cyp6a2进行定量,运用基因碱基数计算公式估算家蝇基因组为295 ±10 Mb ,黑腹果蝇基因组为184 Mb,家蝇基因组的大小为黑腹果蝇的1. 6倍。研究表明家蝇基因组DNA 规模较小,适合完全测序,可以作为基因组分析研究的模式生物。2.2 在昆虫分类和鉴定中的应用B型和Q型烟粉虱具有不同的抗药性,快速而又准确地对烟粉虱生物型进行鉴定是烟粉虱抗性监测和治理的关键Jones等在两种生物型线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅰ基因SNP的基础上,设计制备了两种生物型的TaqMan-MGB探针,建立了TaqMan-MGB等位基因特异的PCR方法,并对已知生物型的烟粉虱进行检验,结果鉴定准确率为100 %。这种快速高通量的鉴定方法在B型和Q型烟粉虱的常规检测和研究B型烟粉虱的入侵方面具有重要的应用意义。 在昆虫检疫中的应用红火蚁是极具破坏力的入侵性生物,是世界范围的潜在性外来入侵生物陈岩等根据GenBank上发表的火蚁属Solenopsis COI 基因序列,设计了检测红火蚁的引物与TaqMan特异性探针,建立了TaqMan探针检测体系,该体系可以准确鉴定各种虫态的红火蚁。Yu等根据辣椒实蝇的mtDNA COI 基因序列,筛选出种特异性引物latillati2 ,建立了SYBR Green实时荧光PCR快速鉴定辣椒实蝇的方法。4 在昆虫抗药性研究中的应用昆虫电压敏感的钠通道基因中的点突变是昆虫对二氯二苯三氯乙烷( DDT) 和拟除虫菊酯类农药产生抗性的主要原因Anstead等采用TaqMan-MGB 探针技术,设计了两条标记不同荧光染料的探针,检测到桃蚜抗性品系中的与抗性相关的两个基因L1014F和M918T与敏感品系相比发生突变,说明这两个基因与桃蚜的抗性密切相关。在此研究中实时荧光定量PCR显示了快速、灵敏、可靠、不需后处理和高通量检测的优点,但要求突变位点已知,测定条件严格,而且对探针设计合成的技术要求高。2.5 在昆虫寄生性昆虫天敌研究中的应用 Tian等通过RACE扩增得到棉铃虫齿唇姬蜂雌蜂卵巢内多分DNA病毒的两个vankyrin 基因。其开放阅读框为507 bp和468 bp ,分别编码168和155个氨基酸。实时荧光定量 PCR 检测结果表明,这两个基因在寄生蜂寄生的整个过程中都能表达,且主要在血细胞中达;期间有2个表达峰,一个在寄生后30 min时表达量最高,拷贝数分别为6. 28 ×104和1. 51 ×105;另一个在寄生后2d,基因的表达量较第一个高峰低10倍。从这个检测结果可以看出,棉铃虫齿唇姬蜂雌蜂卵巢内的多分DNA病毒对寄主幼虫的免疫抑制可能在寄生的早期即已开始起作用。 3 展望 随着荧光标记化学方法和寡核苷酸探针杂交技术的不断发展,生物芯片技术与荧光探针定量技术有机结合,大量先进仪器的发明以及相关检测技术的联合应用,实时荧光定量PCR技术正在向高比、高灵敏度、高通量和微体系检测发展,这将使实时荧光定量PCR技术在昆虫与人类关系植物病原物与媒介昆虫、昆虫核苷酸