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液相色谱基本原理 组分为何要进行分离 色谱方法分类 不同的流动相和固定相构成不同分离方式 HPLC 与 GC 的应用差异 HPLC 与 GC 的应用差异（续） 液相色谱的分类 反相色谱是目前使用最普遍的一种色谱方法 吸附法 固定相为固体 硅胶和氧化铝最常用的固定相 通过一系列的吸附/脱附步骤形成分离 溶质与溶剂均吸附在固定相极性端 样品分子对固定相的吸附程度不同而形成分离 分配法 溶质在液固两相间的相对溶解度不同而达到分离 与固定相亲和力强的物质其保留时间也较强 两种基本操作模式 正相分离：极性固定相、非极性流动相 反相分离：非极性固定相、极性流动相 分配法 正相与反相分离 非极性相互作用 极性相互作用 尺寸排阻色谱 依照分子大小分离 固定相材质具有不同大小孔径 大分子因其经过的路径短，所以先流出 主要应用于聚合物、蛋白质等分子量范围的测定 离子交换色谱 固定相表面带与被分析物相反电荷 一般使用弱离子交换树脂 根据电荷相互作用力的强弱产生分离 离子交换相互作用力 液相色谱仪器组成 液相色谱仪器结构组成示意图 液相色谱的应用 色谱基本理论 色谱的主要理论 热力学理论 以相的平衡观点研究色谱过程 塔板理论为代表 (Martin Synge) 动力学理论 以动力学观点研究各种动力学因素对色谱峰的影响 Van Deemter 方程为代表 分离的原理 样品组分在固定相和流动相之间的分配 流动相带动样品经过色谱柱 不同组分与固定相之间相互作用 的强度不同 不同组分在固定相上移动速度不同， 形成分离 分配系数 KD Xm Xs KD1 = [Xs] / [Xm] Ym Ys KD2 = [Ys] / [Ym] 样品组分的分离 样品组分分离情况 A. 样品与色谱柱固定相无任何作用 三种样品在 t0 时间流出， 无保留 B. 样品组分保留时间一致 与色谱柱作用力相同 C. 样品组分保留时间不一致 样品各组分与色谱柱作用力不同 D. 实际分离状况 高斯分布曲线 色谱出峰形状 实际出峰形状为高斯分布曲线 (Gaussian curve) 样品的扩散效应 分离度 不同分离度 R 相邻两吸收峰分离度 R=1.0, 98% R=1.5, 99.7% R＞1.5 时 两色谱峰被视为 分开 分离度R的数学表达 容量因子 k’ 测量溶质在固定相和流动相中分布的摩尔数 与温度有关 (GC) 与流动相溶剂种类及组成有关 (LC) 容量因子 k’（续） k’ 决定样品能进入色谱柱固定相的量 k’太小，在固定相上保留太短，很快流出，难以确定保留时间 k’太大，在固定相上保留太强，洗脱时间太长， 理想的 k’为 1～5 分离效果与 k’ 值的最优化 k’值的优化 改变溶剂成分、梯度条件 (洗脱强度) 选择因子 ? 色谱柱分开两组分的能力 ? ＞1 时两组分分离 选择因子 ? 的影响因素 影响 ? 的因素 改变流动相成分，包括改变 pH 值 改变柱温 (在 LC 不明显) 改变固定相成分 使用特殊化学效应 选择因子 ? 的影响因素 （续） 改变色谱柱类型 色谱柱效能 衡量色谱柱效率的指标 峰展宽的度量 以塔板数来表示 从分馏技术衍生而来 分馏法依组分的挥发性不同而分馏 色谱法依组分的分配系数不同而分离 分配系数 Kd=Cs/Cm 理论塔板数 N、板高 H 色谱柱效随 N 增大或 H的减小而增加 理论塔板数 N的表达 理论塔板数N 与半峰宽W1/2和保留时间的关系如下 在相同保留时间色谱峰越尖锐，则色谱柱效越高 k’, ? 和 N之间的关系 范德姆特（Van Deemter）方程 Ven Deemter 方程给出理论塔板高度 A—涡流扩散 B/u —纵向扩散 Cu—传质阻力 低的 HETP= 高的色谱柱效率 涡流扩散 (A) 纵向扩散 (B/u) 传质阻力 (Cu) 样品分子在流动相与固定相间转移的难易程度 溶质在流动相与固定相间平衡必须花费一定的时间 主要由流动相及固定相的总量决定 流动相流速越快、达成平衡所需的时间越少、峰变宽效应越小 色谱柱外效应 色谱柱外的死体积 进样器、连接管路、接头、检测器流动池吸光槽 分离效能的最优化 Injection t0 t’R1 t’R2 N=L/H 塔板理论 ? N H = A + B/u + Cu Neff = Lcol / HETP 如果已知有效塔板高度，则可计算色谱柱有效塔板数： fastest