2 液相色谱流动相和固定相的选择.ppt

液相色谱流动相 和固定相选择 流动相导论 溶剂系统 可以是一种或多种水溶液或有机溶剂 携带样品流经色谱柱至检测器 当与样品发生相互作用时，样品则发生分离 选择溶剂需考虑的问题 极性与溶剂强度 纯度、过滤、除气 与其他溶剂的互溶性 缓冲溶液与pH 等梯度或梯度洗脱分析 溶剂的化学性质—混合性、黏度 混合性 混合性不佳，会产生气泡 可先做混合实验，确认互溶性 黏度 高黏度溶剂产生高柱压，降低柱效 溶剂混合时黏度呈非线性变化 注意溶剂梯度混合时最大黏度产生时的压力 溶剂互溶表 溶剂的化学性质—压缩性、折光性 压缩性 瓦里安液相泵可以自动调节不同溶剂混合时的压缩比 折光指数 (RI) 一般溶剂RI值为：1.30-1.40 高分子或含卤素溶剂，RI值为 1.35-1.50 芳香族溶剂RI 值为：1.50-1.55 检测质量与溶质和溶剂的折光指数差有关 溶剂的化学性质— UV吸收 UV cutoff（截至波长） 溶剂在某一波长下经 1cm 光程其吸收值大于 1、则该波长以下的区域称为 UV cutoff 找出适用的波长范围 溶剂的化学性质— 溶剂强度 溶剂强度 (strength) 强流动相会造成较少的静态滞留，得到较短的分析时间 非极性或有机溶剂对反相色谱是较强的溶剂 极性溶剂对正相色谱是较强的溶剂 溶剂的化学性质— 溶剂强度（续） 溶剂强度 示例：反相色谱 随有机溶剂比例增加，分离速度也增加 高百分比的有机溶剂强度较大 流动相的准备 配置流动相 混合、除气、过滤 溶剂的混合 每一组成的溶剂在混合前必须分开测量体积再混合 两种溶剂混合后的体积通常不是分开体积的总和 流动相的准备—除气 气泡的形成 空气在混合溶剂中的溶解度低于纯溶剂 多余的气体将离开溶剂形成气泡 流动相的准备—过滤 需将流动相中的颗粒除去 细小颗粒会阻塞色谱柱 影响泵的使用 影响检测器流通池 储液瓶加盖 溶剂进口加过滤头 加预柱保护色谱柱 流动相的准备—添加剂 缓冲溶剂 维持溶液的 pH 维持生物活性或酸碱交互作用 pH7 可能会造成填料溶解 至少添加 50-100 mM 需避免加入缓冲剂后发生沉淀造成系统损伤 抗氧化剂 保护样品和仪器硬件 选择正确的流动相 合适的流动相 改善分离效果 要求 性质稳定，对色谱柱无影响 与检测器匹配 对样品有很好的溶解性 低黏度、低沸点 纯度高 易得到，价格适中 尽量避免使用有毒溶剂 反相色谱使用的溶剂 多用水作主要的流动相组成 (A) 水极性强、有低的蒸汽压 除极性或离子型溶质外所有疏水性物质均会附着在固定相上造成保留 必须使用色谱级纯水，避免系统污染 调整有机溶剂（作修饰剂） (B) 的浓度 是改变组分保留的主要因素 有三种反相色谱常用的有机溶剂 Acetonitrile, Methanol, THF 正相色谱流动相 使用非极性溶剂作主要的流动相组成 (A) 以一种或多种极性较强的溶剂作修饰剂 (B) 单元成分通常是碳氢化物再加入以下成分 10- 50% chlorinated hydrocarbon 1-5% alcohol 极性相互作用造成分离 流动相和固定相竞争溶质 流动相能吸附在固定相上， 造成溶质在固定相上吸附力的减弱 痕量的水足以改变吸附表面活性 控制水含量是得到较好重现性的主要因素 等度洗脱 等度洗脱不能完全分离样品 某些样品太复杂 较早洗脱出的色谱峰分离度太差 较晚洗脱出的色谱峰变宽或拖尾 考虑梯度洗脱 梯度洗脱 梯度洗脱时流动相强度随溶剂组成的改变而增强 梯度洗脱广泛适用于许多复杂样品与生物、聚合物样品的分离 实验后以强溶剂清洗色谱柱 对未知样品可经梯度找到适当的等度条件 梯度洗脱 梯度洗脱程序 强、弱、急、缓 正相色谱(Normal-Phase) 正相色谱是应用极性固定相和非极性流动相的一种经典液相色谱 分析物通过其极性基团和固定相的极性基团相互作用而保留。分析物依次从低极性到高极性顺序洗脱 正相色谱通常用来分离一些中低极性和一些在低极性溶剂中易溶的分析物。水溶性分析物通常不适意用正相色谱分离 正相柱的类型及其保留能力: Silica NH2 CN 反相色谱(Reversed-Phase) 反相色谱已成为最普遍的液相分离模式。在反相色谱中，是非极性固定相和极性流动相。 分析物通过自身的非极性功能团和固定相非极性基团相互作用而保留。分析物依次从高极性到低极性的顺序洗脱。 反相色谱主要用来分离高中等极性的化合物。 反相色谱柱及其保留能力: C18 C8 C4 C1 离子交换色谱(Ion-Exchange) 离子交换色谱是利用分析物在离子交换树脂上的离子交换能力不同而使组分分离。 固定相是以硅胶或薄壳型聚合