5核酸生化概要.pptVIP

DNA的分离纯化 2、三氯甲烷-戊醇：将DNP溶液和等体积的三氯甲烷-戊醇（3:1）剧烈振荡，离心，上层水相为DNA、蛋白质，下层为三氯甲烷-戊醇，中间层为蛋白质凝胶，反复处理数次，直到两层之间无蛋白质胶状物； 3、去污剂法：用SDS等去污剂可使蛋白质变性 4、酶法：用广谱蛋白酶使蛋白质水解（RNA杂质） （二）RNA的分离纯化 RNA提取液中去除蛋白质的方法 1、苯酚法将组织匀浆用90%本分处理并离心。RNA即溶于上层被苯酚饱和的水层中，而DNA和变性蛋白质在下层为水饱和的苯酚中，上清液中加入乙醇，RNA即呈白色絮状沉淀析出； 2、在10% NaCl溶液中加热至90度。离心除去不溶物，加乙醇使RNA沉淀，或用等电点使RNA沉淀； 3、用盐酸胍法（终浓度2mol/L）可溶解大部分蛋白质，冷却，RNA即沉淀析出； 4、去污剂法：SDS （三）核酸的纯度检测 原理：核酸在260nm处有最大吸收峰 方法：测定核算样品溶液的A260和A280，然后计算A260/A280的比值，纯的DNA样品为1.8，纯的RNA样品的 比值为2.0。 核酸样品中如有蛋白质或苯酚等杂质，比值？ （四）核酸保存：低温、避光、高度消毒，一般核酸存放在浓盐溶液中，在-80度低温冰箱冻存。 核酸含量的测定 （一）定磷法 原理：RNA和DNA中都含有磷酸，RNA的平均含磷量为9.4%，DNA的为9.9%，从样品中测得的含磷量来计算RNA或DNA的含量 用强酸（10mol/L硫酸）将核酸样品消化，使有机磷转变为无机磷，无机磷与钼酸反应生成磷钼酸，后者在还原剂（Vc）作用下还原成钼蓝，比色测定含磷量 （二）定糖法 1、核糖的测定 RNA分子中的核糖和浓盐酸或浓硫酸作用脱水生成糠醛。糠醛与某些酚类化合物（地衣酚）缩合而生成有色（深绿色）化合物。反应产物在660nm有最大吸收，并且与RNA的浓度成正比 核酸含量的测定 2、脱氧核糖的测定 DNA分子中的脱氧核糖和浓硫酸作用，脱水生成ω-羟基-γ-酮基戊醛，与二苯胺反应生成蓝色化合物。反应产物在595nm处有最大吸收，并且与DNA含量成正比。 核酸含量的测定 紫外吸收法 利用核算组分嘌呤环、嘧啶环具有紫外吸收的特性 在260nm测得DNA或RNA溶液的A260，即可计算出样品中核酸的含量 核酸含量的测定 染色体是由DNA和蛋白 质结合而成的复合物， DNA必须经过压缩，压 缩总倍数高达10000倍。 双螺旋 DNA 核小体 螺线筒 套环链 染色单体 染色体 真核染色体的结构模型 7倍 6倍 40倍 5倍 8400倍 5.染色质与染色体 染色质 染色体 （细胞分裂间期） （细胞分裂期） （六）基因与基因组 二倍体细胞 单倍体细胞 （体细胞） （生殖细胞） 纯种 杂种 （等位基因相同） （等位基因不同） 基因组DNA序列分类： 基因序列 非基因序列 编码序列 非编码序列 单一序列 重复序列 结构基因组学 功能基因组学 基因组学genomics 基因座 等位基因 复等位基因 (二) RNA的种类和分子结构 1. RNA的类型 ① rRNA（核糖体RNA） rRNA约占细胞RNA总量的80% 功能：组成核糖核蛋白体，是蛋白质生物合成的场所 原核：蛋白质占1/3； rRNA占2/3 真核：各占一半 ②tRNA（转运RNA） tRNA：一般由73-93个核苷酸组成，是一类最小的RNA，约占细胞RNA总量的15%。 功能：解译氨基酸信息，并转运相应氨基酸。 每种氨基酸都有与其相对应的一种或几种tRNA ③mRNA （信使RNA） mRNA约占细胞RNA总量的3-5%，在代谢上很不稳定，分子量极不均一，种类很多。 功能：传递DNA的遗传信息，是蛋白质合成的模板，每种多肽链都由一种特定的mRNA负责编码 ④干扰小RNA和微RNA 1）干扰小RNA (siRNA) siRNA:是由双链RNA（dsRNA）经特异RNA酶Ⅲ家族的Dicer核酸酶切割形成的19~21个碱基左右的双链RNA； RNAi：将由dsRNA诱导的基因沉默效应称为RNA干扰 RNAi的作用机制: 1、 dsRNA– siRNA 2、RISC识别并降解mRNA RNAi作用机制 1、dsRNA进入细胞后，由依赖ATP的核酸内切酶Dicer切割，将其分解成21～23 bp的双链siRNA。 2、双链siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，反义siRNA与体内特异性蛋白(包括内切酶、外切酶、解旋酶等)结合形成RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)。 3、RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合部位切割mRNA，切割位点即是与siRN