RNA抽提指南概要.docVIP

RNA抽提指南(TRIZOL) 注意事项： * 全程佩戴一次性手套。皮肤经常带有细菌和霉菌，可能污染RNA的抽提 并成为RNA酶的来源。培养良好的微生物实验操作习惯预防微生物污染。 * 使用灭菌的，一次性的塑料器皿和自动吸管抽提RNA，避免使用公共仪 器所导致的RNA酶交叉污染。例如，使用RNA探针的实验室可能用RNA酶 A 或T1来降低滤纸上的背景，因而某些非一次性的物品（如自动吸管）可 能富含RNA酶。 * 在TRIZOL 中，RNA 是隔离在RNA 酶污染之外的。而对样品的后续操 作会要求用无RNA 酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在 150°C 的烘箱中烘烤4 小时。塑料器皿可以在0.5 M NaOH 中浸泡10 分钟， 用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用。 抽提步骤： 1．匀浆化作用 通过离心来沉淀细胞后，弃上清，用移液管加TRIZOL试剂反复吹打来裂解细胞至均一通亮的液态后，将匀浆样品在15—30°C 条件下孵育5 分钟以使核蛋白体完全分解。 （每5—10×106的动物细胞，植物或酵母菌细胞或每1×107 细菌加1ml的TRIZOL。在加入TRIZOL前应避免洗涤细胞因为那样会增加mRNA降解的可能性。） 2．分离阶段 每1 mlTRIZOL 加0.2 ml 氯仿。盖紧样品管盖，用手用力摇晃试管15 秒并将其在30°C 下孵育2—3 分钟。在2—8°C 下以不超过12,000×g 的离心力高速冷冻离心15 分钟。离心后混合物分成三层：下层红色的苯酚-氯仿层，中间层，上层无色的水样层。RNA 无一例外地存在于水样层当中。水样层的容量大约为所加TRIZOL 容量的60% 3．RNA的沉淀 将水样层转移到一干净的试管中，通过将水样层和异丙醇混合来沉淀RNA。最初均化时的每1 mlTRIZOL 对应0.5 ml 异丙醇。将混合的样品在15—30°C 条件下孵育10 分钟并在2—8°C 下以不超过12,000×g 的离心力高速冷冻离心10 分钟。RNA沉淀在离心前通常不可见，形成一胶状片状沉淀附着于试管壁和管底。 （如果希望分离DNA 和蛋白，有机层同样要予以保留。在除去水样层后，样品中的DNA 和蛋白也能相继以沉淀的方式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能沉淀出蛋白。共纯化DNA 对于样品间标准化RNA 的产量十分有用。） 4．RNA的洗脱 移去上层悬液。用75%的乙醇洗涤RNA 沉淀一次，每1 ml 的TRIZOL 至 少加1 ml 的75%乙醇。旋涡振荡混合样品并在2—8°C 下以不超过7,500×g 的离心力高速冷冻离心5 分钟。 5．RNA的再溶解 在操作的最后，简单干燥RNA沉淀。尤为重要的是，不能让RNA沉淀完全干燥那 样会极大地降低它的可溶性。部分溶解的RNA样品其A260/280 比值 1.6。用移液管尖分几次移取无RNA酶的水或0.5% SDS溶液来溶解RNA，并在55—60°C下孵育10 分钟。 TRIzol法抽提总RNA 组织100mg ↓ 加1mlTRIzol ↓ 匀浆（要彻底，后转至EP管） （组织匀浆量100mg时分装1ml/每EP管） ↓ 颠倒混匀10下，室温5分钟（30°C孵育） ↓ 加氯仿1/5体积（0.2ml）（必须按总体积的1/5） ↓ 颠倒混匀15S，室温2-5分钟（30°C孵育） ↓ 4℃，离心12000g，l）于另一1.5mlEP管中 ↓ 加等体积异丙醇（约400 -500μl），混匀室温10分钟 ↓ 4℃，离心12000g，1030°C孵育） ↓ 弃上清 ↓ 加冰预冷的75%乙醇（用DEPC水配）1ml ↓ 4℃离心7500g，5l（10μl-20μl） （可在55-60℃水中，10分钟助溶） RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit 冰上操作：在100μl EP管（经DEPC 水处理过并消毒备用的）中加入 RNA ( ? ) 0.1-5μg Oligo(dT) primer (0.5μg/μl) 1 μl OR randon hexamer primer (0.2μg/μl) 1 μl Deionized water TO 12 μl 离心混匀 2．孵育： 70℃ 5min 0℃ 冰水浴立刻终止 离心 3．加冰上操作 5×reaction buffer