培训课件--蛋白质免疫印迹技术.pptVIP

Western Blot一般流程 蛋白样品的制备 SDS－PAGE 转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色 转移电泳设备 Western－blotting 检测抗血清 转膜 膜的选择 尼龙膜 硝酸纤 维素膜 封闭非特异性抗体结合麻烦 简单快速封闭非特异性抗体结合 价格昂贵 价格便宜 特殊要求下的选择 需要更高的蛋白结合率 （尼龙膜： 480μg/cm2 ；硝酸纤维素膜：80μg/cm2 ） 目的蛋白与硝酸纤维膜的结合能力弱 需要更大的机械强度 转膜 半干法 将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿 润滤纸之间，电转10－30min。 湿法 将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装 置的缓冲液中，电转45min或过夜。 封闭 脱脂奶粉（5％） BSA Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司提供） 一抗、二抗孵育 把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据滤膜面积以0.1ml/cm2的量加入加入一抗溶液与滤膜温育。37℃一小时，4 ℃过夜。 倒掉一抗溶液，用PBS漂洗液滤膜3次，每次10min。 加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动， 37℃一小时，4 ℃过夜。 倒掉一抗溶液，用PBS漂洗液滤膜3次，每次10min。 二抗与底物反应显色 辣根过氧化物酶法（HRP） 碱性磷酸酶法（AP） 化学发光显色法 辣根过氧化物酶EC 1.11.1.7。一