大白菜游离小孢子培养技术高效体系的研究.docVIP

大白菜游离小孢子培养技术高效体系的研究 李　菲1，2　张淑江1　章时蕃1　张　慧1　孙日飞1*　张振贤2 （1中国农业科学院蔬菜花卉研究所，北京 100081；2中国农业大学农学与生物技术学院，北京 100193） 摘　要：以大白菜吉红82、#534DH群体及#438群体为试材，研究了利用细胞破碎仪机械提取小孢子与人工挤压提取小孢 子对大白菜游离小孢子活力及提取量的影响。结果表明：机械提取替代人工挤压可在短时间内同时提取多份样品，并可快 速调整小孢子的培养浓度。收集40个适期花蕾于5 mL离心管内，3 000 r·min-1破碎10 s，将提取的小孢子定容于25 mL NLN-13培养基，可确保小孢子浓度在适宜培养范围内，并成功诱导胚胎发生。 关键词：大白菜；游离小孢子培养；细胞破碎仪 前，通过技术改良，已建立起较为成熟的大白菜小 孢子培养体系（李菲 等，2009），成为芸薹属蔬菜 游离小孢子培养研究的主要作物之一。 大量研究显示，基因型是决定小孢子胚胎发 生能力的主要因素（Ajisaka et al.，1999；Zhang et al.，2003），但与之相关的功能基因的研究还未 见新进展。目前，集中进行大群体材料小孢子培养 难度较大，缺乏高效、稳定的培养体系。现有的培 养体系在小孢子提取环节主要依靠手工挤压，小孢 子胚胎诱导效果受人为因素干扰较大，工作效率 低，是开展群体材料小孢子培养研究的主要障碍。 因此，提高小孢子培养的机械化操作、降低人为干 扰、建立高效培养体系，是推动游离小孢子培养研 究深入开展的前提。本试验尝试将机械化操作引入 大白菜游离小孢子培养体系，利用细胞破碎仪提取 小孢子，研究其对小孢子胚胎诱导效果的影响，以 期建立高效的大白菜规模化小孢子培养体系，为集 中开展大群体小孢子培养、进一步探讨小孢子胚胎 发生的相关研究奠定基础。 1　材料与方法 1.1　材料 供试材料为中国农业科学院蔬菜花卉研究所白 菜课题组选育的大白菜品种吉红82及#534DH群 体材料和#438群体材料。2012年12月26日催芽 播种于中国农业科学院蔬菜花卉研究所育苗室，进 行低温春化处理，2013年3月6日定植于日光温 李菲，女，副研究员，专业方向：蔬菜遗传育种，E-mail：lifei@caas.cn *通讯作者（Corresponding author）：孙日飞，男，研究员，专业方向： 蔬菜遗传育种，E-mail：sunrifei@caas.cn 收稿日期：2013-12-28；接受日期：2014-01-28 基金项目：“十二五”农村领域国家科技计划项目（2012AA100202）， “十二五”国家科技支撑计划项目（2012BAD02B010），农业部园艺作物 生物学与种质创制重点实验室项目 游离小孢子培养技术（isolated microspore culture，IMC）是近年来兴起的单倍体培养方法， 具有单细胞、单倍体和较高胚胎发生率等优点， 可以迅速获得大量纯合的双单倍体植株，为植物 育种和基础研究创造了广阔的应用前景。Lichter （1982）首次报道甘蓝型油菜小孢子培养成功获得 了小孢子胚状体及其再生植株，推动了十字花科芸 薹属蔬菜作物小孢子培养的兴起，芸薹属作物游离 小孢子培养技术得到了快速发展（付颖 等，2011； Ferrie Caswell，2011；顾祥昆 等，2013）。 大白菜〔 Brassica campestris L. ssp. pekinensis （Lour）Olsson〕是原产于我国的重要蔬菜作物， 在我国芸薹属蔬菜中种植面积最大、种类最多，在 生产中占据十分重要的经济地位，围绕大白菜育 种与研究开展的小孢子培养受到了极大重视。近年 来，国内外学者针对影响大白菜游离小孢子培养效 率的诸多因素进行了广泛的研究，明确了小孢子的 发育时期、前期预处理以及供体植株的生长条件、 培养基成分等因素均会影响大白菜小孢子培养的胚 胎发生率（张凤兰 等，1994；刘凡 等，2001）。目 2014（8）：12 - 16 — 12 — 新优品种 栽培管理 本期视点 产业市场 病虫防控 — 12 — 研究论文中 国 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 室，常规栽培管理直至抽薹开花。 1.2　游离小孢子的机械化提取 以吉红82为试材，选取长2～3 mm、小孢子 主要处于单核靠边期的花蕾，先用75%酒精浸泡 30 s，7%次氯酸钠溶液洗涤15 min，无菌蒸馏水冲 洗3遍；然后加入B5改良提取液，进行小孢子提 取（李菲 等，2009）。 采用细胞破碎仪（TOMY MS-100R）进行小 孢子的机械化提取。取50个适期花蕾于5 mL离 心管内，添加B5改良提取液至5 m