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杨树高活性叶绿体提取条件研究 　　摘要 获得高活性的叶绿体是研究树木光合作用的重要环节，以杨树叶片为试验材料，分别用不同蔗糖浓度梯度（0、200、400、600、800 mmoL/L）和pH值梯度（5、6、7、8、9、10）的捣碎液提取叶绿体，并测定所提取叶绿体的叶绿素荧光活性。研究结果表明：在用蔗糖浓度为400 mmoL/L、pH值为9的捣碎液提取的杨树叶绿体Fv/Fm、Fv/Fo、Fm/Fo均最大。这说明蔗糖浓度为400 mmoL/L、pH值为9的捣碎液为最适的提取条件。 　　关键词 杨树；叶绿体；提取条件；叶绿素荧光动力学 　　中图分类号 Q244-3；S792.117 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2013）15-0170-02 　　光合作用是林木生长的物质基础，也是提高林业产量的技术措施的核心，一直是树木生理学的主攻方向之一。叶绿体是进行光合作用的细胞器，要研究光合作用常常需要从叶绿体水平入手。例如，研究快速生长的林木高光效的原因，就需要从叶绿体水平来分析，为相关的分子生物学提供思路；比较多种树木光合功能的差异也往往需要从叶绿体水平来分析。因此，研究树木的光合作用光反应机制更离不开叶绿体提取技术。 　　杨树是我国种植面积最大的树种，在我国林业生产中具有重要的地位。由于杨树叶片的角质层较厚，次生代谢物较多，树木的叶绿体提取难度显著大于菠菜等蔬菜。如何提取高活性叶绿体成为了限制杨树光合作用研究的技术瓶颈。目前，提取叶绿体的常用方法主要是密度梯度离心法。本试验以幼嫩的杨树叶片为试验材料，通过配制具有不同蔗糖浓度梯度和pH值梯度的捣碎液提取叶绿体，然后再测定所提叶绿体的荧光动力学参数，通过比较，筛选出叶绿体活性最大时捣碎液的蔗糖浓度和pH值，为杨树叶绿体的提取提供参考。 　　1 材料与方法 　　1.1 试验材料 　　供试杨树（毛白杨，Populus tomentosa）叶片在5月初采摘，此时的杨树叶片刚刚成熟，比较幼嫩且光合活力最高。叶片采摘后，立即用清水洗净后再用蒸馏水冲洗，然后去除中脉，留下叶片中含叶绿体较多的部分，置于冰箱中4 ℃暗适应过夜，以消耗过多的淀粉。 　　1.2 试验方法 　　1.2.1 叶绿体的提取。叶绿体的提取过程均在4 ℃和黑暗中进行。暗适应过夜的叶片用捣碎液在电动捣碎机中捣碎，经过4层纱布和16层纱布2次过滤后，以220×g离心2 min，去除沉淀；上清液以1 200×g离心后得到的沉淀即为叶绿体。捣碎液中含有20 mmoL/L Tris、15 mmoL/L NaCl、2 mmoL/L EDTANa2，蔗糖浓度分别为0、200、400、600、800 mmoL/L，pH值用HCl和NaOH调至5～10。 　　将沉淀所得的叶绿体用保存液（20 mmoL/L Mes，pH值6.5；0.4 moL/L蔗糖；35 mmoL/L NaCl）悬浮，匀浆。调叶绿素浓度为1.5 mg/mL，分装后用液氮速冻，最后在-70 ℃保存。叶绿素浓度测定参照张其德（1985年）的方法[1]，取10 μL叶绿体悬浮液，用80%的丙酮5 mL稀释，以5 000×g离心后测定上清液中叶绿素浓度。 　　1.2.2 叶绿体荧光活性的检测。叶绿体暗适应30 min以后，把叶绿体色素浓度稀释为750 μg/mL，然后取500 μL于测量小管中，用PEA（Plant Efficiency Analyser；Hansatech Instru-ment Ltd.，UK）测定叶绿体的叶绿素荧光活性。测定光源为3个发光二极管提供的波长650 nm的红光，光照强度为3 000 μmoL/（m2·s），使光聚集在直径为4 mm的试验材料上，荧光信号的记录时程为2 s。Fv/Fm表示光系统Ⅱ（Photo-system Ⅱ，PSⅡ）最大或潜在光化学效率；Fv/Fo代表PSⅡ活性状态；Fm/Fo用来表示通过PSⅡ的电子传递情况[2]。每个处理设置6个重复。 　　2 结果与分析 　　2.1 不同浓度捣碎液对叶绿体活性的影响 　　从图1可以看出，蔗糖的浓度影响Fv/Fm。当蔗糖的浓度小于400 mmoL/L时，随着蔗糖浓度的增加，Fv/Fm逐渐增大。当蔗糖的浓度为400 mmoL/L时，荧光参数Fv/Fm达到最大，比蔗糖的浓度为0 mmoL/L时高出12%。当蔗糖的浓度大于400 mmoL/L时，随着蔗糖浓度的增加，Fv/Fm逐渐减小。 　　从图2可以看出，Fv/Fo也受蔗糖浓度的影响。当蔗糖的浓度小于400 mmoL/L时，随着蔗糖浓度的增加，Fv/Fo逐渐增大。当蔗糖的浓度为400 mmoL/L时，Fv/Fo最大，比蔗糖的浓度为0 mmoL/L时高出34%。当蔗糖的浓度大于400 mmoL/L时，随着蔗糖浓度的增加