液相色谱—串联质谱法测定双壳类水产品中原多甲藻酸类贝类毒素.docVIP

液相色谱—串联质谱法测定双壳类水产品中原多甲藻酸类贝类毒素 　　摘 要：建立了双壳类水产品中原多甲藻酸贝类毒素Azaspiracid 1（AZA1）、Azaspiracid 2（AZA2） 和Azaspiracid 3（AZA3）的液相色谱-电喷雾串联质谱检测方法。选用具有基质代表性的扇贝、牡蛎和杂色蛤为研究对象，样品经80%甲醇-水混合溶液提取，正己烷脱脂、氯仿反提萃取并旋转蒸发浓缩后，MAX混合型阴离子交换反相吸附固相萃取柱净化，Luna C18 色谱柱（150 mm×2.0 mm，5 μm，Phenomenex公司）反相液相色谱法分离，乙腈和0.1%甲酸溶液组成的流动相梯度洗脱，正离子扫描，多反应监测（MRM）模式下电喷雾串联质谱法测定和确证，外标法定量。结果表明，3种原多甲藻酸类贝类毒素均在4 min内出峰，检出限均为1.5 μg/kg，在0.3～30 μg/L范围内线性良好，平均回收率大于80%，相对标准偏差（RSD）小于12%（n=6）。 　　关键词：贝类毒素；原多甲藻酸；双壳类水产品；液相色谱-串联质谱 　　1 引 言 　　原多甲藻酸（Azaspiracids， AZAs）贝类毒素是一类脂溶性聚醚生物毒素，由原多甲藻（Properidininm crassipes）产生，碳骨架由40个碳原子组成，分子中有20个立体异构中心和9个环，具有独特的6，5，6-三螺环和环胺结构（化学结构见图1），属氨代螺旋酸类贝类毒素。AZA1在AZAs贝类毒素中最为常见，[TS（][HT5”SS] 图1 原多甲藻酸类贝类毒素化学结构图 　　Fig.1 Chemical structure of azaspiracids （AZAs） 　　AZA1： R1=H， R2=CH3 ； AZA2： R1=CH3， R2=CH3； AZA3： R1=H， R2=H.[HT5][TS）]且所占比例最高，AZA2和AZA3则分别是AZA1的8-甲基和22-脱甲基衍生物，这3种贝类毒素构成了原多甲藻酸类贝类毒素的主要成分[1]。AZAs贝类毒素毒性强且比较稳定，AZAl， AZA2和AZA3对小鼠腹腔注射致死剂量分别为200， 110和140 μg/kg[2]，人食用含有AZAs贝类后会出现恶心、呕吐、腹泻、胃痉挛等症状。2002年3月，欧洲委员会规定双壳类水产品中AZA1，AZA2和AZA3的最大允许浓度为160 μg/kg （以贝肉计）[3]。 　　小鼠生物检测法（MBA）是以往检测贝类毒素的常用方法，但因其存在不能判定多种毒素的具体组分，灵敏度和准确性均欠佳，重现性差等缺点，已被欧盟于2011年采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）法取代[4]。目前，对AZAs贝类毒素的检测多限于AZA1 [5～8]，而AZA1的测定结果不能作为双壳类水产品中AZAs是否超标的判断依据，且所建检测方法还存在着样品处理操作繁琐，耗时长等问题。本研究针对以上问题，完善了目标分析物的种类，改进了样品处理方法，提高了分析效率，为双壳类水产品中AZAs贝类毒素残留的监控及检测提供了技术支持，为贝类产品的品质控制和质量提高提供了可靠保证。 　　2 实验部分 　　2.1 仪器、试剂与材料 　　API4000液相色谱-串联质谱仪（美国应用生物系统公司），配有电喷雾离子源；T25 basic型均质器（德国IKA公司）；2-16K型高速离心机（德国Sigma公司）；MS3型涡旋混合器（德国IKA公司）； RV 10型旋转蒸发仪（德国IKA公司）；固相萃取装置、MAX混合型阴离子交换反相吸附固相萃取小柱（美国Waters公司）。Mill-Q纯水仪（美国Millipore公司）。 　　原多甲藻酸标准品：AZA1、AZA2和AZA3（加拿大海洋生物科学研究所，纯度≥95%）；甲醇、乙腈（色谱纯，美国Burdick Jackson公司）；甲酸（色谱纯，美国Dikma公司）；氯仿（农残级，美国Tedia公司）；正己烷和乙酸钠（优级纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）。实验用水由Mill-Q纯水仪制备。 　　3 结果与讨论 　　3.1 质谱条件的选择和优化 　　取90 μg/L AZAs标准溶液，采用流动注射方式分别注入离子源。在正离子检测方式下对AZAs进行一级质谱扫描获得各分子离子峰[M+H]+，再对各母离子进行二级质谱扫描获得相应的特征子离子峰[M+H-H2O]+ 和[M+H-2H2O]+。然后通过多反应监测（MRM）扫描模式对去蔟电压（DP）、入口电压（EP）、碰撞气能量（CE）、碰撞室出口电压（CXP）等参数进行优化，使分子离子与特征碎片离子强度达到最大，确定最佳质谱参数。AZAs分子结构中C20与C21位上存在两个羟基，二者会被电离， 失去氧原子上的