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芫花ISSR—PCR扩增反应体系的优化 　　摘 要：以芫花（Daphne genkwa）DNA为模版，利用单因素试验，分析DNA模版、Mg2+、dNTP、TaqDNA聚合酶和引物对ISSR-PCR反应的影响，适合芫花的ISSR-PCR的反应体系：20μl 反应体系中含2.5mmol/L Mg2+，0.2mmol/L dNTPs，1.0u TaqDNA聚合酶，0.8μmol/L引物，40ng模板DNA。 　　关键词：芫花；ISSR-PCR；体系优化 　　芫花（Daphne genkwa）为瑞香科瑞香属多年生落叶灌木，其干燥花蕾为著名中药。目前，有关芫花的研究多为化学方面的，分子方面的仅见SRAP分子标记，本文采用单因素试验，建立了适合芫花的ISSR-PCR反应体系，旨在为芫花遗传多样性研究奠定基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 植物材料。在6个地点（陕西省安康市、河南省确山县、安徽省大别山、江苏省南京市江宁区、江西省南昌市以及浙江省衢州市的苏庄镇）采集芫花样品，用硅胶迅速干燥叶片，放入-70℃的超低温冰箱中备用。 　　1.1.2 试剂与仪器。天根生化科技（北京）有限公司的DNA提取试剂，上海生工公司的ISSR引物，大连宝生物有限公司的DNA Taq聚合酶、Mg2+、dNTPs，南京生兴生物技术有限公司的琼脂糖，北京鼎国生物技术有限公司的100bp DNA Ladder Plus Marker。 　　Bio-Rad Peltier Thermal Cycler品牌的PCR仪， Bio-Rad Universal holdⅡ凝胶成像分析仪，电泳仪及电泳槽，水浴锅，超低温高速离心机等。 　　1.2 方法 　　1.2.1 DNA的提取与检测。利用植物基因组提取试剂盒提取芫花基因DNA。利用紫外分光光度法和琼脂糖凝胶法检测DNA的浓度和纯度。将DNA存入-20℃冰箱备用。 　　1.2.2 ISSR-PCR反应体系的建立。原初的扩增反应体系为20μl，含1.5mmol/L Mg2+，0.2 mmol/L dNTPs，1.0mol/L引物，DNA聚合酶1.0U，基因组DNA（模版）40μg。 　　1.2.3 ISSR-PCR反应扩增程序。PCR反应在PTC-221型Bio-Rad扩增仪上进行，ISSR-PCR扩增程序：①94℃预变性5 min；②PCR扩增38个循环，每个循环94℃，变性45 s；③48～60℃复性45 s（退火温度随引物不同而定）；④72℃延伸1.5 min；⑤72℃延伸7 min；⑥4℃保存。 　　1.2.4 引物筛选及退火温度确定。随机用2个芫花DNA对UBC系列100条引物进行ISSR-PCR扩增（退火温度统一设为54℃），筛选出扩增条带清晰的引物。再用3个DNA样品进行复筛，选择反应稳定、多态性好、重复性好的引物，用于全部样品的ISSR-PCR扩增。 　　对筛选的ISSR 引物的退火温度（Tm 值）进行梯度试验，即在PCR 仪上设置温度最小为48 ℃，最大为60 ℃，自动形成12个梯度（48、48.3、49、50、51.4、53.1、55.2、56.9、58.2、59.1、59.8、60℃），筛选出每条引物的最适退火温度。 　　1.2.5 ISSR-PCR反应体系的优化。参照邹枚伶、史锋厚等建立ISSR反应体系的各因子参数，Mg2+（1.25、1.5、1.75、2、2.25、2.5、3mmol/L），dNTPs（0.1、0.15、0.2、0.25、0.30 mmol/L），Taq DNA聚合酶（0.5、1、1.5、2、2.5U），引物（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0μmol/L），模板DNA（10、20、30、40、50、60、70、80ng）。 　　1.2.6 ISSR-PCR反应的电泳检测。ISSR扩增产物采用1xTBE缓冲液，进行1%琼脂糖胶（含EB）电泳，100bp DNA ladder Marker作为分子量标准，电压为3V/cm-1，BIO-RAD UVP凝胶成像系统扫描记录图片。 　　2 结果与分析 　　2.1 DNA提取 　　利用植物基因组提取试剂盒，所提DNA浓度高（212ng/μl），杂质少（OD260/OD280=1.87），可以满足ISSR分子标记要求。 　　2.2 引物筛选及退火温度确定 　　对100个ISSR引物筛选，共筛选出11条扩增条带清晰、且有较高多态性条带的引物。引物名称及退火温度分别为UBC826（55℃）、UBC827（55℃）、UBC834（50℃）、UBC835（57℃）、UBC846（50℃）、UBC857（53℃）、UBC864（53℃）、UBC873（52℃）、UBC86（53℃）、UBC895