脂质组学血清样品处理方法及其快速高分辨液相色谱—质谱分析.docVIP

脂质组学血清样品处理方法及其快速高分辨液相色谱—质谱分析 　　摘 要：通过系统考察血清样本前处理方法、优化液相色谱条件及质谱检测参数，建立了脂质组学血清样本前处理及其快速高分辨液相色谱-质谱（RRLC-MS）分析方法。血清样本中加入二氯甲烷-甲醇（CH2Cl2-CH3OH，2∶1， V/V）混合溶剂进行脂质提取，采用ACQUITY UPLC CSH C18色谱柱（100 mm × 2.1 mm，1.7 μm），以10 mmol/L 甲酸铵溶液（含0.1% 甲酸）为流动相A，乙腈-异丙醇（1∶1， V/V）为流动相B，梯度洗脱，采用正负离子检测模式电喷雾电离（±）ESI、正离子检测模式大气压化学电离 （+）APCI方式进行质谱检测。对血清中脂肪酸、甘油脂、鞘磷脂、甘油磷脂和胆固醇（酯）5类14种代表性脂质类成分进行了方法学考察。结果表明，方法灵敏度高、精密度及稳定性良好。对穿插在检测序列中的质控样本检测结果进行主成分分析（PCA），证明了本方法获得数据的可靠性良好，适用于脂质组学研究。 　　关键词：脂质组学； 血清前处理方法； 液相色谱-质谱 　　1 引 言 　　随着20世纪系统生物学的兴起，在代谢组学的基础上，2003年脂质组学研究正式被提出[1]，并被应用于疾病诊断、药物开发等领域的研究[2]。在脂质组学研究中，从生物样本中提取脂质类成分的完整性对脂质组学分析方法有非常重要的意义。传统“金标准”法即“Folch or bligh and dyer recipes”法（采用CHCl3-CH3OH（2∶1， V/V）混合溶剂）是目前最常用的脂质类成分提取方法[3～5]。然而氯仿具有致癌性[6]，且氯仿降解后产生光气、氯化氢气体，可能使不稳定的脂质类成分发生化学修饰[7]，影响脂质组学分析测定的准确性。目前文献报道了改进的二氯甲烷-甲醇（CH2Cl2-CH3OH）提取法[8]和甲基叔丁基醚-甲醇（MTBE-CH3OH）提取法[9]以及两种方法分别与金标准方法的对比研究[9～11]。但是未见对3种提取方法的系统比较，文献报道的脂质组学分析方法中未见关于样本稳定性的考察研究[8，12，13]。本研究采用（±）ESI、（+）APCI相结合的RRLC-MS技术，可以获得含有更全面质谱信息的脂质组学数据。选取血清中14种代表性脂质类成分，系统考察了脂质类成分的提取方法，并对分析过程中涉及到的处理前、处理过程中及处理后的血清样本在不同放置条件及存放时间进行稳定性考察与验证，旨在排除外界因素对测定结果的影响，保证分析结果的客观性[14～16]。 　　2 实验部分 　　2.1 仪器与试剂 　　Agilent 1200系列快速高分辨液相色谱仪（德国Waldbronn Aglient technologies 公司）；QTRAPTM5500型四极杆-线性离子阱串联质谱仪（美国Applied Biosystems/MDS SCIEX公司），配有ESI源、APCI源及Analyst 1.5.1数据处理系统。 　　脂质类成分标准品的信息见表1（依据网站Lipid Maps（http：//） 命名），甲酸铵（色谱纯）均购自美国Sigma-Aldric公司。乙腈、异丙醇和甲酸（色谱纯，Merck公司）。实验用水为某品牌纯净水。 　　2.3 脂质类成分标准品及血清样本的制备 　　（1）脂质类成分标准品混合液：称取14种脂质类成分标准品适量，分别溶于CH2Cl2-CH3OH（2∶1， V/V）混合溶剂，制备标准品贮备液，SM（d18∶1/16∶0）和PE（14∶0/14∶0）浓度为0.1 mg/mL； PC（18∶1/18∶1）、PC（18∶1/0∶0）和CE（9∶0）浓度为0.5 mg/mL；Chol.浓度为10 mg/mL；其余均为1.0 mg/mL。取不同体积的14种脂质类成分标准品贮备液，混匀后稀释至1 mL，所有脂质类成分的浓度按其在人体血液中的正常浓度配制（少数成分除外，各脂质类成分在人体血液中的正常浓度范围均由网站HMDB（http：//www.hmdb.ca）获得），记为Mixture 1。将Mixture 1进行10倍、20倍稀释，即人体血液正常浓度的1/10和1/20倍，分别记为Mixture 2和Mixture 3。 　　（2）血清样本：血清在4℃下解冻，取血清30 μL，加入CH2Cl2-CH3OH（2∶1， V/V）（含0.1 g/L 2，6-二叔丁基-4-甲基酚，0℃）混合溶剂600 μL，涡旋并静置，加入水200 μL，离心后移取有机相氮气吹干，加入乙腈-异丙醇（CH3CN-IPA，1∶1， V/V）混合溶剂500 μL复溶，10000 r/min离心10 min后取上清进样。30例健康人血清分别按以上方法处理后，