HCV非結构蛋白和结构蛋白在复制和感染中的作用.docVIP

HCV非结构蛋白和结构蛋白在复制和感染中的作用 【摘要】?丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)在1989年即已分离获得,但由于HCV很难在体外培养且在血中滴度很低,一直阻碍了HCV的研究和抗病毒药物的开发,因此HCV体外培养细胞模型和小动物模型的建立是HCV研究的关键问题之一。基于HCV 2a型JFH1株的细胞模型的建立解决了部分难题。JFHI株是由Kato等于2001年从日本1例暴发性丙型肝炎患者体内获得的,其基因型为2a,JFH1能在体外高效复制并产生感染性的病毒颗粒。但迄今为止,无需突变即能在体外高效复制并产生感染性病毒颗粒的仅限于JFH1株,而JFH1株不能完全代表其他主要基因型的流行特征。因此建立能够支持其他基因型尤其是我国最主要的基因型1b型复制的细胞培养系统成是当前HCV研究的迫切任务。自1999年复制子模型系统被首次描述以来,人们通过对复制子的研究发现,NS5A蛋白是参与HCV复制的重要因子,NS5A通过与其他复制蛋白作用后,形成一个激活的复制复合体,起始HCV在体内的复制。复制子的非结构基因在体外细胞培养中会发生适应性突变(adaptive mutation),将适应性突变预先引入复制子中能够提高克隆形成率(efficiency of colony formation,ECF),适应性突变一般出现在NS3、NS4B和NS5A区,部分突变位点之间有协同效应,其中NS5A的适应性突变导致高度磷酸化的NS5A蛋白形式(p58)下调,从而促进亚基因组或全基因组的复制;或者是突变后与其他的复制阻遏蛋白的结合变弱,促进复制复合体的形成,从而也促进复制子的复制。HCV core蛋白的氨基酸序列十分保守,在各型中的同源性达到95%。Core蛋白在包裹病毒RNA,维持其固有的外在形态和病毒所致持续感染中发挥关键作用。HCV的结构基因和非结构基因产物之间的相互作用对细胞培养中产生的HCV感染性颗粒是至关重要的。Core蛋白在HCV的感染颗粒包装和产生中起重要作用。已有研究表明,HCV在core蛋白表达受阻的情况下,其病毒的复制会在一定程度受到抑制,但对于core蛋白具体的作用机制,目前相关的研究还很少。病毒入侵感染的首要步骤是与宿主细胞膜上的相应受体结合,形成一个配体-受体复合物。HCV结构蛋白中包膜蛋白E,就是这样一种受体结合蛋白,以E1/E2二聚体的形式,与宿主细胞膜上的CD81,SR- BI,claudin1,occludin等分子结合后,以复合体的形式介导HCV的入侵。乙型脑炎病毒(JEV)和HCV都属于黄热病毒,基因结构非常相似,均为单股正链RNA病毒。JEV结构蛋白中的囊膜糖蛋白E,也是介导HCV入侵细胞的关键分子。JEV不仅能感染人,也能感染小鼠。已有报道,HCV的JFH1株,能在小鼠细胞内复制,但是不能包装出具感染性病毒颗粒。因此,在本研究中我们用基因置换的方法研究NS5A、C以及E区置换对HCV复制和感染的影响,以期为建立1b基因型的细胞培养模型以及小动物模型建立基础。本研究首先比较J4NS5A基因置换FL-J6JFH1相应区域后构建的嵌合子FL-J6JFH/J4NS5A与野生型FL-J6JFH1复制和感染的差别。接着用人工定点突变的方法对嵌合子NS5A的三个复制相关位点氨基酸改变(S2197P,S2201del,S2197P+S2201del,S2197P+S2204I),比较突变前后复制能力的差别。同时用基因置换的方法用J4 core平行置换FL-J6JFH1构建嵌合复制子FL-J6JFH/J4core,比较置换前后复制能力的差别。此外,本研究还用同属黄热病毒的乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)的E区基因置换HCV的相应区域,构建了HCV/JEV嵌合复制子,比较HCV细胞亲嗜性的改变,以期建立跨种感染的HCV细胞模型。一、JFH1 NS5A基因置换对FL-J6JFH1复制和感染的影响以我国HCV最主要基因型(1b型J4株)的NS5A替换FL-J6JFH的相应基因得到嵌合型FL-J6JFH/J4NS5A,与野生型FL-J6JFH1,以及复制缺陷型阴性对照FL-J6JFH(GND)线性化后体外转录成RNA,用脂质体分别转染Huh-7.5.1细胞。比较三者转染细胞在培养过程中HCV RNA水平差异。转染后第5,8,12天抽提细胞总RNA,逆转录成cDNA后作为模板,以HCV特异的荧光定量PCR(FQ RT-PCR)检测细胞内HCV的RNA水平。结果显示,在检测的三个时间点上嵌合体转染细胞内HCV RNA水平一直低于野生型转染的细胞。在第5天,FL-J6JFH转染细胞内HCV RNA为1.1×106 GE/μg RNA,第8天,下降到9.5×105