基于香菇全基因组序列开发的部分SSR标记多态性分析与品种鉴定初探.docVIP

基于香菇全基因组序列开发的部分SSR标记多态性分析与品种鉴定初探 　　利用香菇（Lentinula edodes）全基因组序列信息开发的35个香菇SSR （simple sequence repeat） 分子标记用于中国25个香菇品种的鉴定。所选SSR标记共检测出174个条带，各引物检测到的条带数量变化范围为2～12。筛选出的7对SSR引物组合显示了良好的品种特异性鉴定能力，可以有效地鉴定部分国审香菇品种。 　　香菇； 全基因组序列； SSR； 品种鉴定 　　简单序列重复（simple sequence repeat， SSR），又称微卫星DNA，是以2～6个碱基为重复基元的串联重复序列，广泛存在于高等生物的基因组中。在众多的分子标记方法中，基于PCR的SSR标记具有位点特异、共显性、复等位、基因组中分布广泛等特点，成为构建连锁遗传图谱、研究群体遗传学、绘制品种指纹图谱、筛选目标性状分子标记及分子标记辅助育种等的理想工具。在未知基因组序列信息的情况下，一般可从EST序列[1]或通过构建微卫星文库[2，3]开发SSR标记。此过程需构建文库并测序，步骤繁琐、耗时长、开发的标记数量少、难度大、成功率低[4]，限制了SSR技术的普遍应用。与ESTSSR相比，基于全基因组信息开发的SSR类型更多、多态性更高、分布更广泛[5]。随着下一代全基因组测序技术的普及，获得全基因组信息进而开发SSR已经变得十分快捷，其开发与应用将会越来越多。 　　香菇（Lentinula edodes）是我国十分重要的栽培食用菌，近年来栽培地域、季节得到快速拓展，产量增长较快。香菇栽培的快速发展需要多品种支撑，目前通过国审的香菇品种已经超过20个，各地还有许多同种异名或同名异种的品种在大量使用。为满足不同栽培需求而进行的多品种配套使用很容易造成菌 只炻遥现厥被嵊跋煜愎秸I踔辆惹行枰焖佟⒆既返木帧安啊奔ǚ椒ā；谙愎交蜃樾蛄械腟SR标记的开发对于我国香菇资源的遗传结构分析，分子标记辅助育种，我国主栽香菇品种的亲缘关系理清具有重要应用价值。 　　1材料与方法 　　1.1菌株 　　1.2SSR引物开发与合成 　　香菇L135菌株2个原生质体单核体135A、135B及其转色阶段的转录组交由深圳华大基因科技有限公司进行测序，测序采用solexa和454相结合的方法，测序深度为6倍。用SSRhunter1.3软件[6]对香菇基因组中SSR的总数、分布、motif类型等信息进行了分析。利用primer premier 5.0[7]软件，设计了108对SSR引物，委托生工生物工程（上海）有限公司合成。 　　1.3SSR引物扩增片段多态性初步分析 　　选用香菇栽培菌株L808、香九及另外2株野生菌株HN10Le317、 HN10Le318的DNA为模板，对合成的108对SSR引物进行预扩增。将预扩增筛选得到的SSR引物对25株栽培品种和2株野生菌株进行扩增试验。 　　1.4香菇栽培品种鉴定 　　1.6SSR基因型鉴定 　　1.7凝胶电泳及数据分析 　　PCR扩增反应完成后，将12 μL 1×加样缓冲液加入20 μL PCR扩增产物中混匀，于95 ℃变性5 min，结束后置于冰水混合物中冷却3 min，点样3 μL于6%变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，电泳缓冲液为1×TBE，电压1000 v，电流200 mA，功率200 W，电泳45 min，银染，显色，拍照，分析结果。 　　2结果与分析 　　2.1香菇基因组测序及SSR引物 　　2.2SSR引物多态性 　　选用香菇栽培菌株L808、香九及另外2株野生菌株HN10Le317、 HN10Le318的DNA为模板预扩增结果表明，有79对引物得到扩增产物，其余29对引物未得到扩增产物。将预扩增筛选得到的79对SSR引物对25株栽培品种和2株野生菌株进行扩增试验，发现其中74对引物表现出多态性，大多数标记为单拷贝引物，少数为多拷贝位点引物。 　　2.3香菇栽培品种多位点SSR指纹图谱 　　3讨论 　　与其它类型的分子标记相比，单个SSR位点所能检测到的等位变异的数目是最高的，尤其是基于全基因组信息开发的SSR具有更高的多态性。且在一定长度范围内，SSR的长度与其多态性呈正相关关系[1，9]。与XIAO等[10]基于EST开发的SSR引物进行了比较，发现他们的SSR引物在25份栽培菌株中的多态性很低，24对引物中，只检测到8个多态性标记，其SSR等位片段变化范围为2～6。相对于EST开发的SSR，基于基因组信息所开发的SSR显示出量大、基因组覆盖面广、多态性高的优点。 　　SSR分子标记用于品种鉴定具有操作简单、结果准确的特点，已经用于作物的DUS鉴定[11]和双孢蘑菇（Agaricus bisporus）