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SARS病毒单抗体的制备 细胞工程 细胞工程 目的探讨制备和鉴定SARS冠状病毒N蛋白单克隆抗体快速免疫方法，为人类健康保驾护航！ 程心诚  细胞工程之SARS单抗体的研究制备 信息关键字：SARS 冠状病毒 单克隆抗体 杂交瘤细胞 筛选方法 方法：用基因重组SARS冠状病毒N蛋白和免疫2周的BALB/c小鼠制备,并采用ELISA间接法、免疫荧光和免疫印迹进行筛选和鉴定.结果筛选出4株抗SARS冠状病毒N蛋白单抗体杂交瘤细胞株,ELISA间接法和免疫荧光证实这组单克隆抗体仅与SARS冠状病毒特异性反应,而与其他病原体无交叉反应,IgG亚类鉴定2株为IgG1,另2株分别IgG2a和IgG2b.2株抗体亲和常数分别为4.14×10-9M和3.19×10-9M.结论获得特异性针对SARS冠状病毒的单克隆抗体,为SARS的早期诊断、蛋白组学和发病机制的研究奠定了基础. 制备流程图： B细胞获取抗原接种 B细胞获取 抗原接种 瘤细胞复苏 细胞融合与筛选 细胞融合与筛选 注射SARS 注射SARS病毒N蛋白 杂交瘤细胞 杂交瘤细胞 细胞培养 细胞培养 纯化、检测等抗体制备 纯化、检测等 抗体制备 抗原接种——————皮下接种 接种对象：目前应用最广的是小白鼠和大白鼠，尤以小白鼠为好。就品系而言以Balb/c小白鼠应用最广，因为所有的小白鼠骨髓瘤系均从Balb/c小白鼠系诱导出来。Balb/c系小白鼠必须用纯系的，雌雄均可，以8~12周龄为宜。 一般而言，抗原的纯度不很重要，只要足够引起免疫反应即可，特别是免疫原性较强的抗原。 效应B淋巴细胞制备 注：以免疫三天后取样，此时分离的Ｂ淋巴细胞最适于后续的融合。 (1) 免疫过的血清抗体滴度高的Balb/c鼠，拉颈或用CO2处死小白鼠。 (2) 将小鼠放于70％酒精中浸泡消毒，取出固定于板上，在无菌条件下取脾。 (3) 把脾放入5ml含有2.5％FCS的1640液中，冰浴下轻轻洗去脾上的红血球。 ——反复离心分离镜检――—略过。 瘤细胞复苏 注：瘤细胞必须来自于和B细胞同品系的Balb/c鼠，消除细胞融合时起免疫反应。 ①该瘤细胞系的来源应与制备脾细胞小鼠为同一品系，以便两者的组织相容性抗原一致；②骨髓瘤细胞必须是静息状态，不产生γ球蛋白或不分泌到细胞外；③骨髓瘤细胞生长需要一个较高的细胞密度,最好106个细胞/ml；④生长速度快，繁殖时间短。 骨髓瘤细胞一般由有关单位直接引入，保存于-195℃ 细胞融合与筛选 （1）、取末次免疫后的第3天小鼠脾细胞悬液，将108小鼠脾细胞与1-5×107SO2/O小鼠骨髓瘤细胞混合于50毫升刻度离心管中，经1000转/分离心7分钟； （2）、弃上清液，尽可能除得干净，用手指轻叩离心管底部，使沉淀混匀如糊状，离心管置37℃ 3）、将37℃水浴中保温的50%PEG1.0毫升（实际应用0.7毫升）用滴管缓慢滴入离心管中，在60秒钟内滴完，在37℃水浴中边滴 4）、加完PEG后，将细胞悬液放在37℃水浴中静置90秒钟，立即在2—4分钟内加入15毫升无血清的RPMI-1640培养基（37℃），开始要一滴一滴地加，由于稀释使 5）、再经100转/分离心10分钟。弃去上清液，加25毫升HAT培养液，轻轻混匀，将混悬液分装已有巨噬细胞的两个24孔培养板中，每孔0.5毫升； 6）、将培养板放在水蒸汽饱和CO2孵箱中，37℃孵育。CO2含量为5% 7）、每2—3天换一次HAT培养液，连续2周观察杂交瘤细胞是否出现。2周后使用HT培养基。 杂交瘤细胞培养与生产 一、对于选育出来的杂交瘤细胞，还要对其进行驯化、实验室小试、中试后才能进入化工厂生产。 二、工艺路线的优化。 三、培养条件的控制与优化。 四、发酵设备的设计改造等等 单克隆抗体的分离制备、纯化及检测 经过人工手段，单克隆抗体是一种高效分泌胞外蛋白，其分离制备方法与其他活性蛋白方法具有一般相似性。 已完成的或正在研制多种抗SARS 病毒疫苗中, SARS 灭活和减毒病毒疫苗的研究已取得一定成果, 但由于该类疫苗本身的一些生物学特性, 应用受到了限制, 因此新型基因工程疫苗仍是研究的重点。 参考文献： [1] 鲍海逊,夏梅,缪凤琴,谢维,张建琼. SARS冠状病毒S蛋白基因片段的表达及其单克隆抗体的制备[J]. 东南大学学报(医学版), 2009,——19页 [2] ] 戚扬; 郝俊勤; 迟淑萍; 孙艳玲; 赵景民; 程云; 用抗SARS冠状病毒N蛋白单克隆抗体定位研究受染器官，传染病信息, 2009年 01期?--32页? [3] 杨保安，抗SARS冠状病毒中和活性单克隆抗体的筛选及其结合位点分析，中华微