人參皂甙Rh2诱导人喉癌细胞株Hep2凋亡的研究.docVIP

人参皂甙Rh2诱导人喉癌细胞株Hep-2凋亡的研究 摘要!目的: 研究人参皂甙Rh-2( G-Rh2) 诱导喉癌Hep-2细胞凋亡的作用。方法: 应用流式细胞术、琼脂糖凝胶电泳检测G-Rh2处理前后Hep-2细胞的凋亡情况, 并应用SP免疫组化法检测药物处理前后相关基因产物Bax、Bcl-2蛋白的表达, 观察G-Rh2对喉癌Hep-2细胞的诱导凋亡作用及其对细胞周期的影响。结果: ( 1) G-Rh2具有诱导凋亡作用, 且呈量效、时效关系, 细胞凋亡率随G-RH2浓度及作用时间的增加而升高, 并可将细胞周期阻滞于G0/ G1 期。( 2) G-Rh2处理Hep-2后, Bax表达上调, Bcl-2在G-Rh2处理前后无明显变化。结论: G-Rh2对体外培养的Hep-2细胞具有诱导凋亡的作用, 其机制可能与上调Bax的表达及细胞周期阻滞有关。 关键词!人参皂甙Rh-2; 喉癌; 细胞凋亡; 细胞周期 喉癌是常见的耳鼻咽喉恶性肿瘤, 占耳鼻咽喉各种恶性肿瘤的第三位。目前, 喉癌的治疗仍以手术为主, 然后辅以化疗以延长患者生存率。而大量抗癌药物是通过诱导细胞凋亡而发挥其细胞毒作用的。所以, 促进肿瘤细胞凋亡成为恶性肿瘤化疗的新目标。 人参皂甙Rh2( Ginsenoside-Rh2, G-Rh2) 是近年来从人参中分离出来的一种有效成分, 属于人参二醇型四环三萜类低糖链皂甙单体, 体内、外实验表明, 它通过诱导分化或凋亡抑制肿瘤细胞的增殖, 并证明其对正常组织毒性很低。本实验以人喉癌Hep-2细胞株为实验对象, 研究G-Rh2通过诱导凋亡对Hep-2细胞株的抑制作用, 从而为喉癌的临床治疗提供更多的实验依据。 1 材料与方法 1. 1 细胞株及细胞培养 人喉癌细胞株购于北京同仁医院耳鼻咽喉研究所, 培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养液中( 含100IU/ ml 青霉素和0. 1mg/ml 链霉素) , 于37# 、5%CO2恒温培养箱中培养, 细胞呈贴壁生长, 达80%左右时传代。传代用0. 25%的胰蛋白酶消化。 药品与试剂 G-Rh2购自吉林大学医学部天然药物化学研究室, 制成针剂, 浓度为20g/ L、纯度?98%, 用时以RPMI1640培养液稀释为不同浓度。琼脂糖和吖啶橙购自Sigma公司, 兔抗Bax 多抗及鼠抗Bcl-2单抗购自武汉博士德公司, 核糖核酸酶(RNase)和碘化丙啶( PI) 购自华美生物试剂公司。 1. 3 实验方法 1. 3. 1 流式细胞仪检测G-Rh2诱导凋亡的量效关系及细胞周期分析: 取对数生长期的Hep-2以1%105cell/ cm2接种于培养瓶中, 贴壁培养24小时后弃去上清, 处理组加入含不同终浓度( 10、20、40、80
mol/L) G-Rh2的培养液, 对照组加入等量培养液。培养24小时, 经0. 25%胰蛋白酶消化后, 收集约1%106个细胞。PBS洗涤, 制成单细胞悬液, 用70%的冰乙醇4℃固定12h。于PI 一步染色液中染色30min后做流式细胞仪分析。 1. 3. 2 流式细胞仪检测G-RH2诱导凋亡的时效关系: 细胞取样、计数、培养同上。根据以往采用MTT法检测G-Rh2对Hep-2细胞的生长抑制作用的结果,其半数抑制浓度( IC50) 为38. 6μmol/ L, 因此我们选择40
mol/ L( IC50的近似值) G-Rh2分别作用0、12、24、48h后, 检测凋亡率。 1. 3. 3 琼脂糖凝胶电泳法: 细胞取样、计数、培养、分组同上。37℃培养24h后终止培养, 分别收集各组悬浮和贴壁细胞至1. 5mlEP管中, 每管用细胞裂解液500μl 重悬细胞后加蛋白酶K至终浓度100μl/ ml,50℃水浴3小时。经酚/ 氯仿抽提一次, 2. 5倍体积的无水乙醇沉淀DNA。1. 2%的琼脂糖凝胶电泳约1小时, 比较各组DNA电泳带型特点。 1. 3. 4 免疫组化: 细胞取样、计数同上, 接种于置有小盖片的24孔培养板中, 实验组加入含G-Rh240μmol/ l的培养液, 对照组加入等量RPMI1640培养液。每组设3个复孔, 于37℃ 孵箱内培养48小时后, 收集细胞, 制备细胞涂片。采用SP免疫组化法检测Bax 和Bcl-2的表达, DAB显色, 苏木素浅染, 光镜下观察, 以胞浆或胞膜出现棕黄色颗粒为阳性细胞。 1. 4 统计处理
采用X2检验进行统计分析。 2 结果 2. 1 G-Rh2诱导Hep-2细胞凋亡的量效、时效关系 采用流式细胞仪检测凋亡细胞, 各处理组细胞凋亡率随G-Rh2浓度增高而递增, 见表1。在40
mol/ l G-RH2作用下, 不同时间处理组细胞凋亡率随处理时间的延长而增高,