人參皂甙单体Rh2对K562细胞增殖和凋亡作用的实验研究.docVIP

人参皂甙单体Rh2 对K562细胞 增殖和凋亡作用的实验研究 摘 要: 目的 研究人参皂甙单体Rh2( GS-Rh2)对人K562细胞增殖和凋亡作用的影响。方法 采用MTT比色法观察GS-Rh2对体外培养的K562细胞生长的抑制作用; 在光学显微镜下观察不同浓度GS-Rh2 对K562细胞的凋亡作用及计数凋亡率( AR)。结果 MTT比色法测定显示, 细胞经GS-Rh2作用后生长受抑制, 呈剂量依赖性和时间依赖性, 半数抑制浓度( IC50)为25. 8μg/ml 。结论 GS-Rh2能抑制体外培养的K562细胞增殖并诱导其凋亡。 关 键 词: 人参皂甙-Rh2; K562细胞; 增殖; 凋亡 近年来研究发现, 人参具有抗肿瘤、抗衰老等多种生物活性作用, 其主要活性成分人参皂甙( Ginsenoside, GS)能诱导肿瘤细胞的分化和凋亡, 从而发挥抗肿瘤的作用。人参皂甙单体-Rh2( GS-Rh2)是一种原人参三醇型皂甙, 是红参的主要抗癌成分。我们以人红白血病K562细胞株为受试对象, 研究GS-Rh2对K562细胞增殖和凋亡的影响, 从而为开发抗肿瘤新药提供实验依据。 材料与方法 1.1 材料 K562细胞株(购自中国科学院上海生物细胞研究所); GS-Rh2(购自吉林省宏久生物科技股份有限公司); RPMI
1640培养基(购于美国Gibco公司); 小牛血清( FBS) (杭州四季青生物工程公司产品); 超净工作台(哈尔滨市东联电子技术开发有限公司); CO2培养箱(上海易亮医疗器械有限公司); 倒置显微镜;酶联免疫检测仪。 1. 2 细胞培养 K562细胞用含12%小牛血清的培养液(含100IU/ml青霉素和0. 1mg/ml链霉素), 于37℃, 5%CO2恒温培养箱中培养, 细胞呈悬浮生长, 达80%左右时传代。 1. 3 药物处理 细胞传代后, 接种于96孔培养板内, 当细胞为50%~60%时, 换用含有不同浓度GS-Rh2的培养液。培养至预定时间后进行观测。 1. 4 GS-Rh2对细胞生长的抑制作用 取对数生长期细胞制成细胞悬液, 浓度为1*105ml-1, 接种于96孔培养板内, 每孔100μl，6h后加入不同浓度的GS-Rh2, 使终浓度分别为6. 25、12. 5、25、50和100μg/m,l 每一浓度组均设4孔。对照孔及调零孔加100
l培养液。各孔总体积均为200μl 。分别在加药后6、12、24、48和72h采用MTT法检测各孔中细胞的抑制率。用酶联免疫检测仪在570nm波长下测各孔的吸光度( A值), 按下列公式计算抑制率( IR): IR(%) = ( 1-给药孔平均A值/对照孔平均A值) *100%。具体步骤见参考文献。根据不同浓度下的抑制率绘制量效曲线,由此计算出IC50值。 1. 5 胞光镜形态学观察 在倒置显微镜下观察各实验组和对照组细胞并拍照。 1.6 GS-Rh2诱导凋亡的时效关系 取25. 0μg/ml( IC50的近似值) GS-Rh2分别作用0、12、24和48h后, 检测凋亡率(AR)。 1.7 统计学分析 采用SPSS11. 0软件包计量资料t检验, 所有数据用x正负s表示。 2 结果 2. 1 GS-Rh2 对K562细胞生长的抑制作用 于药物处理后48h, 采用MTT法测得各组的抑制率( IR), 结果表明: K562细胞的抑制率对GS-Rh2的浓度有明显依赖关系, 当GS-Rh2 浓度为6. 25、12. 5、25. 0、50. 0和100. 0
g/ml时, IR分别为21. 5%、38. 6%、64. 2%、80. 4%和84. 6%, 采用SPSS统计软件进行曲线拟合, 计算出GS
Rh2 对K562细胞的半数抑制浓度( IC50) 为25. 8
g/ml( 图1)。25μg/mlGS-Rh2 处理作用于细胞不同时间, 采用MTT法计算抑制率, 结果如表1所示。 2.2 细胞形态学观察 在倒置显微镜下可以观察到对照组K562细胞体积大, 多呈圆形, 核圆形或椭圆形, 核浆比例大, 胞浆内未见颗粒, 常聚集生长; 而实验组随着GS-Rh2浓度的增加凋亡的K562细胞逐渐增多且更加明显。部分细胞呈现典型的凋亡细胞形态学改变, 细胞分散, 体积缩小, 胞浆浓缩, 核浆比例减小, 细胞核膜消失, 细胞核断裂呈小块或碎片状, 但细胞膜较完整并可见凋亡小体, 见图2。 2. 3 GS- Rh2诱导K562细胞凋亡的时效关系 由表2可见, 在25μGS-Rh2 作用下, 凋亡率随作用时间延长而呈现递增的趋势。 3 讨论 1. GS-Rh2 是由人参中提取的天然活性成分, 可经不同途径而抑制多种肿瘤细胞株