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硕士学位论文 HIV-1 Tat38-61(51N/55N)碱性区突变体库的构建及亲和筛选 Construction of HIV-1 Tat38-61(51N/55N) Basic Region Mutation Libraries and Affinity Screening 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其它人已经发表或撰写过的研究成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在文中作了明确的说明并表示谢意。本人承担本声明的法律责任。 学位论文作者签名： 签字日期： 年 月 日 学位论文使用授权书声明 本人完全了解第二军医大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权第二军医大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。（保密的学位论文在解密后适用本授权书） 学位论文作者签名： 导师签名： 签字日期： 年 月 日 签字日期： 年 月 日目 录 中文摘要 1 ABSTRACT 5 缩略词表 10 前 言 11 第一部分 HIV-1 Tat(38-61)融合蛋白的表达及免疫原性分析 13 1. 实验材料 15 2. 实验方法 20 3. 实验结果 23 4. 讨 论 27 第二部分 HIV-1 tat38-61(51N/55N)碱性区突变体库的构建 29 1. 实验材料 31 2. 实验方法 33 3. 实验结果 36 4. 讨 论 40 第三部分 HIV-1 Tat38-61(51N/55N)碱性区突变体库的亲和筛选 42 1. 实验材料 43 2. 实验方法 43 3. 实验结果 45 4. 讨 论 47 总 结 49 综 述 50 参考文献 55 附 录 个人简历 57 致 谢 58 中文摘要 人类免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus，HIV）归属于逆转录病毒科中慢病毒属，主要经血液、性接触及母婴垂直途径等传播，可引起获得性免疫缺陷综合症（Acquired Immune Deficiency Syndrome，AIDS），即艾滋病。目前，艾滋病感染已经成为全球所面临的重大公共卫生问题。研制有效的HIV 疫苗是艾滋病防治的重要手段之一。因此，探索HIV疫苗研究的新策略和寻找新的疫苗靶点对疫苗的成功研发显得尤为重要。 HIV-1反式激活蛋白(Trans-activator of transcription，Tat) 是HIV感染早期产生的一种重要调控蛋白，在HIV-1的复制、扩散和致病中起重要作用。HIV-1感染靶细胞后，胞质中合成的Tat转移到核内，与多种转录调控因子结合组成转录起始复合体（transcription initiation complex, TIC）,促进病毒RNA的转录、延伸和病毒复制。此外，Tat还可被感染细胞通过多种方式分泌到胞外发挥“病毒毒素”的作用：①通过诱导CD4+ T细胞、NK细胞或B细胞的凋亡，发挥其免疫抑制的作用；②通过JAK/STAT信号转导途经激活HHV-8的复制，或通过RGD(Arg-Gly-Asp)与内皮细胞αvβ3和α5β1整合素结合，与可溶性炎症因子和血管生成因子协同促进卡波济肉瘤（Kaposi’s sarcoma,KS）的形成；③通过影响神经细胞钙流，诱导巨噬细胞和小胶质细胞表达TGF-β、TNF等神经毒性物质，发挥神经毒作用，促进艾滋病脑病的发生。 Tat 碱性氨基酸富集区 (49-57aa)是Tat的穿膜和核定位功能基序，是Tat蛋白的主要中和表位之一。其中和抗体可消除Tat分子所特有的穿入其他细胞发挥毒性的核心功能，从机制上能对阻止艾滋病和免疫抑制的发生有重要作用。此外，Tat碱性区序列在各亚型间高度保守，有利于产生交叉反应谱更广的抗体。本研究拟利用噬菌体展示技术分子进化平台，对天然Tat碱性区进行重组改造和筛选，构建由碱性区突变片段经随机连接肽相互连接的重复串联的噬菌体展示文库，用含有高中和活性的抗-Tat兔抗血清进行进化筛选，获得新型免疫原的代表性序列。 本研究分以下三部分进行： HIV-1 Tat(38-61)融合蛋白的表达及免疫原性分析 功能研究表明：Tat蛋白碱性区（49-57aa）介导Tat蛋白穿膜，与Tat细胞外活性密切相关。结构研究表明：Tat分子为天然非折叠蛋白，属于无规则卷曲类型的分子，缺乏稳定的二级结构和高级结构，其分子构想极不稳定，出于快