加味爛积丸微生物限度检查方法验证的研究.docVIP

加味烂积丸微生物限度检查方法验证的研究 成都九芝堂金鼎药业有限公司 王红涛 加味烂积丸收载于《部颁标准》中药成方制剂第二册89页，由大黄、牵牛子（炒）、陈皮、木香、川木香、21味中药组成，具消积化滞之功效。为保证用药安全有效，确保沉香理气丸的抑菌活性及测定方法的可靠性，在此对本品细菌、霉菌及酵母菌数计数方法及大肠埃希菌的检查方法进行了验证，以确认所采用的方法适合于该药品细菌、霉菌及酵母菌数的测定及大肠埃希菌的检查。具体方法如下： 试验依据：《中国药典》2005版一部微生物限度检查法方法验证试验 细菌、霉菌及酵母菌数测定的方法验证 一.菌液制备 1．取经37℃培养18-24小时，大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌营养肉汤培养物1ml加9ml 0.9%的无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-5 ~10-7，为50~100个/ml，做活菌计数备用。 2．取经25℃ 培养24-48小时的白色念珠菌改良马丁液体培养物1ml加9ml0.9%的无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-5~10-6，为50~100个/ml，做活菌计数备用。 3．取经25℃培养1周的黑曲霉菌斜面培养物，加3ml0.9%的无菌氯化钠溶液洗下霉菌孢子，吸菌液1ml加9ml0.9%的无菌氯化钠溶液，逐管10倍稀释为10-4~10-5约50~100个/ml，做活菌计数备用。 二.供试液制备 称取加味烂积丸样品10g，加PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，作为1：10的供试液。 三.验证方法 验证试验应进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。 1)试验组：取供试液各1ml和50~100cfu/ml上述五种试验菌株，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，待凝固后，置规定温度培养24~72小时观察结果，按平皿法测定其菌数。 2)菌液组：测定每一菌株加的试验菌数。 3)供试品对照组：测定供试品本底菌数。 药品微生物限度检查方法验证试验记录 检品名称 加味烂积丸 批号 060001 检验目的 微生物限度检查方法验证 检验日期 2006年11月2日 检验依据 《中国药典》2005版一部 报告日期 2006年11月13日 方法：阳性菌液制备：采用10倍稀释法。 枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]稀释至10-6 金黄色葡萄球菌[CMCC(B) 26003]稀释至10-6白色念珠菌[CMCC(F)98001]稀释至10-6 黑曲霉[CMCC(F)98003]稀释至10-5 大肠埃希菌[CMCC(B) 44102]稀释至10-7 回收率计算： 回收率=(试验组的平均菌落数-供试品对照组平均菌落数)/菌液组的平均菌落数×100% 菌落计数结果表 以下数据均为平行制备2个平皿的平均菌落数。 试验次数：第一次 大肠埃希菌10-7 金黄色葡萄球菌10-6 枯草芽孢杆菌10-6 白色念珠菌10-6 黑曲霉10-5 试验组 138 157 132 159 132 菌液组 67 76 51 77 60 供试品对照组 83 83 83 83 83 回收率% 82.1 97.4 96.1 98.7 81.7 试验次数：第二次 大肠埃希菌10-7 金黄色葡萄球菌10-6 枯草芽孢杆菌10-6 白色念珠菌10-6 黑曲霉10-5 试验组 140 142 134 141 131 菌液组 71 80 69 65 56 供试品对照组 78 78 78 78 78 回收率% 87.3 80.0 81.2 96.9 94.6 试验次数：第三次 大肠埃希菌10-7 金黄色葡萄球菌10-6 枯草芽孢杆菌10-6 白色念珠菌10-6 黑曲霉10-5 试验组 139 132 135 134 127 菌液组 62 68 66 71 53 供试品对照组 81 81 81 81 81 回收率% 93.5 82.3 81.8 74.6 86.8 大肠埃希菌检查的方法验证 试验方法： 1.试验组：取1：10的加味烂积丸供试液10ml及10~100cfu大肠埃希菌菌株加入胆盐乳糖培养基中； 2.阴性对照组：取1：10的加味烂积丸供试液10ml及10~100cfu金黄色葡萄球菌菌株加入胆盐乳糖培养基中； 取以上两种样品按照大肠埃希菌检查法进行检查，试验结果见下表： 大肠埃希菌验证试验结果表 检验步骤 胆盐乳糖培养基 MUG试验 靛基质 结论 试验组 ＋ ＋ ＋ 检出大肠埃希菌 阴性对照组 － － － 未检出 结果判断： 试验结果显示：在3次独立的平行试验中，加味烂积丸对枯草芽孢菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠杆菌、黑曲霉、大肠埃希菌回收率均超过70%，符合要求，故进行细菌及霉菌、酵母菌数计数时可采用常规法测定；对于大肠埃希菌的检查，采用金黄色葡萄球菌为阴性对照，