14细胞凋亡.pptVIP

Apoptotic HeLa cells were stained with FITC-AnnexinV+PI 线粒体膜势能（??mt）的检测 线粒体荧光染料：Rhodamine 123、DiOC6（3）、JC-1、TMRM等对线粒体膜电位非常敏感，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。 DNA片段化分析 细胞凋亡时主要生物化学特征是其染色质发生浓缩, 染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂, 形成180?200bp整数倍的寡核苷酸片段, 在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(DNA ladder)。 凋亡相关蛋白TFAR19蛋白的表达 和细胞定位分析 TFAR19（PDCD5）是由本研究室在国际上首先报导的一个拥有自主知识产权的人类新基因，前期的功能研究表明，它是促进细胞凋亡的增强剂。利用荧光素（FITC）标记的TFAR19单克隆抗体为探针，对细胞凋亡过程中TFAR19蛋白的表达水平及定位研究发现，凋亡早期TFAR19表达水平增高并出现快速核转位现象，伴随着细胞核形态学的变化，持续较长时间，在凋亡小体中仍然可见。方法：ELISA、 Western blot 分析 a. TFAR19蛋白的细胞定位分析 b. TFAR19蛋白的表达与临床疾病 c. 原发性肿瘤细胞和正常细胞的TFAR19蛋白的表达水平。 Double staining analysis of nuclear localization of TFAR19 in K562 and HeLa cells treated with VP16(170?m) 坏死:染色质释放,细胞器肿胀,絮状线粒体,瓦解,胞内物质释放,炎症 凋亡:温和盘绕,染色质浓缩,断裂,胞质压缩,＆片段,巨噬细胞,凋亡小体 * 线粒体与细胞凋亡 线粒体参与细胞凋亡或坏死的途径 释放caspase活化因子 细胞色素C：细胞色素C+Apaf-1+ caspase9—凋亡体 AIF（凋亡诱导因子） Caspase3 Apaf-1：凋亡蛋白酶活化因子 (二) 线粒体通路 五. 凋亡的效应分子 细胞凋亡的分子机制虽然还不十分清楚，但Caspase即半胱天冬蛋白酶在凋亡过程中是起着必不可少的作用，细胞凋亡的过程实际上是Caspase不可逆有限水解底物的级联放大反应过程。 半胱氨酸蛋白酶，水解底物天冬氨酸C端肽键，因此又称之为Caspases(取英文Cysteine C，aspartic acid ，Asp ，proteases的词头) Caspase家族的结构与分类 ICE亚类Caspase蛋白酶：ICE是单核细胞来源的参与成熟的一种蛋白酶，参与凋亡但不起主要作用； Caspase1，Caspase4， Caspase5， Caspase11 Caspase12， Caspase13， Caspase14。 凋亡启动亚类Caspase蛋白酶：Caspase8， Caspase2， Caspase 9，Caspase10。 凋亡效应亚类Caspase蛋白酶：Caspase3， Caspase6， Caspase7 Caspase家族的特点 以酶原的形式存在，需要活化：同源活化和异源活化,活化后形成四聚体的蛋白水解酶，发挥生物学作用 C端同源区存在半光氨酸激活位点 Caspase分：启动酶和效应酶 Caspase活化机制： Caspase的活化是有顺序的多步水解的过程，虽然分子各异，但是它们活化的过程相似。 首先在caspase前体的N-端前肽和大亚基之间的特定位点被水解去除N-端前肽，然后再在大小亚基之间切割释放大小亚基，并进而形成两两组成的有活性的四聚体, Caspase的效应机制 凋亡细胞的特征性表现，包括DNA裂解为200bp左右的片段，染色质浓缩，细胞膜活化，细胞皱缩，最后形成由细胞膜包裹的凋亡小体，然后，这些凋亡小体被其他细胞所吞噬。 破坏细胞抗凋亡因素 正常活细胞因核酸酶处于无活性状态，这是由于核酸酶和抑制物结合在一起，如抑制物被破坏，核酸酶即可激活，引起DNA片段化。现知caspase可以裂解这种抑制物而激活核酸酶，因而把这种酶称为Caspase激活的脱氧核糖核酸酶（caspase-activated deoxyribonulease CAD），而把它的抑制物称为ICAD。有意义的是CAD只在ICAD存在时才能合成并显示活性，因而ICAD对CAD的活化与抑制是必需要的。 破坏细胞结构 Caspase可直接破坏细胞结构，如裂