精确定量组织细胞线粒体DNA拷贝数方法的建立.docVIP

精确定量组织细胞线粒体DNA拷贝数方法的建立. 戴纪刚 肖颖彬 闵家新 张国强 张在永* 重庆第三军医大学新桥医院胸心外科（400037） [摘要]：目的: 建立一种精确定量组织细胞线粒体DNA拷贝数的方法。方法: 结合两个单独的实时荧光定量PCR对待测样本中线粒体HV1和核β-globin 基因分别进行定量。以线粒体DNA HV1和核单拷贝基因β-globin分别作为线粒体和核DNA拷贝数的标记，对肺组织线粒体DNA 的含量进行了精确定量（拷贝数/细胞，即相对拷贝数/二倍体核基因组（diploid nuclear genome）= 2 × HV1 / β-globin）。结果:肺组织线粒体DNA的平均拷贝数/细胞为733±196，与传统的定量方法相比，该技术可对线粒体DNA拷贝数进行准确地测定，并计算出线粒体DNA拷贝数绝对数量的变化。结论: 这一方法能准确定量组织中mtDNA拷贝数的改变，为探讨线粒体DNA拷贝数改变与肿瘤等疾病的相关性提供了条件。 关键词：线粒体DNA、拷贝数、含量 A method to quantify the content of mitochondiral DNA in tissue samples Dai Ji-gang, Zhang zai-yong* Xiao Ying-bin , Min Jia-xin, Zhang Guo-qiang, Wu Qiu-Ping, Yu Zu-Bin ( Department of Thoratic Cardiovascular Surgery of Xinqiao Hospital Chongqing 400037) Abstract: Objective To develop a method to quantify the content of mitochondiral DNA in tissue samples. Methods The content of mitochondiral DNA in nomal lung tissue samples from patients were analyzed by fluorogenic 5,-nuclease real-time PCR techniques. Results The mean copy number of mtDNA in lung tissue samples was 733±196. Conclusions The method to quantify the content of mitochondiral DNA is of help to study the role of mtDNA in carcinogenesis of carcinoma. Key words mtDNA; Copy number; Content; 线粒体是真核细胞的重要细胞器，是细胞的“动力工厂”和细胞凋亡调控的关键元件。哺乳动物线粒体DNA (Mitochondrial DNA，mtDNA)是一全长为16.5kb左右的双链闭环分子。与核基因组相比，其相对分子量小，缺乏组蛋白保护，易受致癌物攻击，且缺乏损失修复系统。此外，由于线粒体内氧浓度很高，易产生氧自由基及过氧化氢等物质，它本身又不能合成谷胱甘肽而将这些过氧化物有效地清除，因此mtDNA易受氧化物损伤，发生突变及拷贝数的改变。呼吸链的正常组合和运转需要一个完整和功能性的线粒体基因组，而mtDNA功能的完成既依赖于每一个mtDNA分子结构的完整性，也同时依赖于细胞中mtDNA的拷贝数。许多研究表明，mtDNA大片段或全基因组的缺失及其量的变化对肿瘤、衰老及某些遗传疾病的发生可能具有重要作用。临床方面，拷贝数异常变化已在越来越多线粒体遗传缺陷的患者中被证实。Southern杂交和比较PCR技术是以往检测各种组织中线粒体DNA拷贝数的较为常用的方法，但这些方法均为定性或半定量研究。为更准确定量组织中线粒体mtDNA拷贝数的改变，探讨其与肿瘤等疾病的相关性，我们结合两个单独的实时荧光定量PCR，建立了一种精确定量组织mtDNA的拷贝数(拷贝数/细胞)的方法。 材料和方法 1 病例资料 37例肺组织标本均取自第三军医大学附属新桥医院2003～2004年外科手术患者，均为癌旁肺组织标本。本组患者男性28例，女性9例，吸烟及曾经吸烟者24例（吸烟者：每天吸烟10支以上且吸烟时间超过1年。本组中包括曾经吸烟现戒烟1年以上者9例），不吸烟者13例。患者年龄30～75岁，中位年龄为55岁。 2 组织基因组DNA提取 采用酚、氯仿、异戊醇抽提法提取全基因组