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大肠杆菌BL21感受态的制备和保存方法研究 焦 亮（细胞生物学 2009111107000732） [摘要] 目的：描述一种改良的大肠杆菌感受态制备和保藏及质粒的转化方法．方法：将CaCl2溶液改为TB溶液；其次是将培养基由LB换成NZY，并分别比较了不同冷冻保护剂(7%DMSO，10％甘油)于－20℃、－80℃冰箱保存感受态细胞的效果。结果：以TB溶液制备感受态细胞，冰浴转化10min后直接涂平板筛选转化子，获得与常规转化方法相当的转化效率,而以7％的DMSO为冷冻保护剂保存感受态细胞可维持10 [关键词] 大肠杆菌；感受态细胞；制备方法；转化率；保存 Study on Preparation and Storage of Competent Escherichia coli BL21 Cells Jiao Liang [Abstract]Objective: An efficient method was described for the E. coli preparation，storage and plasmid transformation. Methods: Normal conditions were changed, from CaCl2 solution to TB solution, LB medium to NZY medium and compared different conditions for storage of competent cells. Results: High transformation efficiency was achieved by preparing the competent cells with TB solution, transforming for 10 minutes, and then following the direct selection on Amp+ LB plate, and Cells stored with dimethylsulfoxide in -80 [Key words] competent cells; Escherichia coli; Preparation; storage 大肠杆菌感受态细胞的制备是实验室分子克隆的重要试验之一，在实际操作中，由于感受态细胞的转化效率受到诸多因素的影响，如离子强度、热击参数、培养条件、保存温度及时间等，转化效率很不稳定。很多实验室采取不同的方法来提高感受态细胞的转化效率，但由于这些方法重复率性差，应用并不普遍。本文总结出一种制备大肠杆菌高效感受态细胞的方法并优化了高效感受态保存的方法。 1材料与方法 1.1 材料 E. coli BL21由湖北大学分子生物实验室保存；质粒pet23a-his-RECQL 为湖北大学分子生物实验室构建。 细菌培养基：LB固体培养基和NZY液体培养基参考文献[1] TB(CaCl2)溶液：Pipes 3.021g/L,CaCl2·2H2O 2.205g/L,KCL 18.637g/L,MnCl2·4H2O 10.885g/L.所有成分除了MnCl2 外被混合并且KOH将PH值调至6.7。然后将MnCl2 溶解，溶液通过0.45μm的过滤器过滤灭菌并于4℃ 1.2 方法 1.2.1标准质粒制备：常规碱裂解法抽提质粒，琼脂糖凝胶电泳检测，紫外分析仪下观察，将显示为超螺旋DNA带型的凝胶切下．胶回收后电泳确保质粒全部为超螺旋状态．紫外分光光度计测其纯度及浓度，TE稀释为1ng／μl，存于-20℃ 1.2.2 大肠杆菌感受态细胞的制备。将大肠杆菌E. coli BL21划线接种于LB固体培养基平皿上，于37℃下倒置培养16-18h；将单菌落接种于装有100ml NZY 培养液的500ml 三角瓶中，18℃下振荡培养至光密度OD600值0.8-0.9，将三角瓶在冰上放置10min；然后将菌液转移至离心管中4800r/min离心10min，去上清，回收细胞；用冰冷的TB溶液悬浮细胞，立即置冰上放30min；于4℃条件下4800r/min 离心7min 1.2.3 转化及转化率测定：参考文献[2] 1.2.4 贮存方法：新鲜制备的感受态细胞，分批加入终浓度7%DMSO、10%甘油，分装后，分别于-80℃ 2 结果与分析 2.1 培养皿内菌落生长状态 转化试验组含抗菌素平板上长出的菌落即为转化体，质粒对照组无受体菌，质粒DNA不能单独存活，不长出菌落；受体菌对照组在不含抗菌素平板上有大量菌落长出，在含抗菌素平板上无菌落长出，是因为E. coli BL21 在含抗生素的培养基上不能生长，说明该试验未产生抗药性突变株；而转化试验组在两种条件下都能长出菌