大腸杆菌SPA的提取表达及鉴定.docVIP

PAGE PAGE 1 SPA的提取、表达及鉴定 班级： 08级生物技术试验班 学号： 姓名： 指导老师： 时间:2010年9月13日～11月19日 目 录 §1 前言（背景介绍） 3 1.1 SPA介绍 3 1.2 实验原理/ 5 §2 材料与方法 7 2.1实验材料 7 2.2实验方法 8 2.2.1试剂的配制、灭菌及无菌接种 8 2.2.2 蛋白的提取 9 2.2.3 SDS检测表达的蛋白质 10 2.2.4 western blotting 11 §3 实验结果与讨论 12 3.1结果汇总 12 3.2结果讨论 13 3.3注意事项 14 参考文献 15 §1 前 言 1.1 SPA介绍 1.1.1 SPA简介 金黄色葡萄球菌A蛋白(Staphylococcal Protein A、简称SPA)是细胞壁抗原的主要成分，几乎90%以上的菌株均含有这种成分，但不同的菌株含量差别十分悬殊。SPA占整个细胞壁蛋白成分的6.7%，通过胞壁肽聚糖以共价键与之结合。其它葡萄球菌如表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌不含SPA。 1.1.2 SPA的理化性质 SPA是一种蛋白质,由亮、缬、脯、丙、苏、甘、丝、谷丙、天门冬及赖氨酸等十种氨基酸组成。由于不含有胱氨酸及半胱氨酸，所以无二硫键。紫外光谱和吸收系数为A275nm %=1.65，等电点为pH5.1。SPA十分稳定，用4mol/L尿素、硫氰盐酸、6mol/L的盐酸胍和pH2.5的酸性条件，以及加热煮沸均不影响其活性。其分子量因测定方法不同而有所差异。 1.1.3 SPA的免疫学性质 Spa能与人以及多种哺乳动物血清IgG分子中的Fc片段结合,结合的亲和性次序依次是猪、狗、兔、猴、小鼠、及牛；对马、犊牛、山羊等无亲和力：对所有的鱼类、两栖类、爬行类、鸟类（除少数例外）均不结合，结婚的亚类主要是IgG1、IgG2和IgG4 。研究表明：IgG与APS的结合部位是CH2和CH3的交界处,这种结合不会影响免疫蛋白的活性。 1.1.4 SPA的生物学特性 　　1．免疫原性与过敏原性 SPA做为免疫原能刺激免疫活性细胞合成Ig，又能与其相应抗体的Fab段结合呈现抗原抗体的特异性反应。SPA－IgG注射家兔皮下可引起Arthus样反应，还可引起豚鼠的迟发性超敏反应。SPA体外试验，能刺激豚鼠离体回肠收缩。 　　2．抗吞噬作用 由于IgG的Fc段结合点既是lgG调理活性结合点，又是SPA反应点。因此，SPA可与吞噬细胞竞争，结果抑制了多形核白细胞的吞噬作用，也可能是SPA阻断调理素与吞噬细胞作用的结果。 　　3．固定补体 SPA－IgG和免疫复合物一样可以固定人和某些动物(如豚鼠、猪、狗等)血清中的补体，主要是通过补体传统激活途径。 　　4．促有丝分裂因子 SPA是一种B细胞激活剂，固相SPA作用明显，并不需要T细胞辅助,可容性SPA作用微弱，必须有T细胞参与。 5．去封闭作用 固相SPA能部分去除肿瘤病人和带瘤动物血清中的封闭活性，从而降低了血清对淋巴细胞介导的细胞毒的封闭作用。 1.1.5 SPA的应用 　　SPA应用很广，但所有应用的原理都离不开SPA具有与IgG的Fc段的结合能力，主要应用方面如下： 　　1．SPA菌的协同凝集作用： 用已知的标准血清，吸附到SPA菌的表面,使之成为吸附抗体的载体,再以此去诊断相应的未知抗原而产生肉眼可见的凝集颗粒,诊断的抗原可以是颗粒性的,也可以是可溶性的。此种凝集相当于反向间接血凝,但省去间接血凝中的抗体纯化,红血球鞣化等复杂手续,而只需要 SPA菌体及粗制免疫血清即可。所以此法简单、快速,特异性敏感性均较满意。目前已用于许多细胞和病毒的检测及分型。 2. 作为广谱第二抗体： 用SPA代替抗体IgG的第二抗体，有如下优点： ①SPA制备容易，性质稳定，易纯化，对人和多种哺乳动物的IgG都能应用,不受种属限制。而第二抗体的制备比较麻烦，且需多次免疫动物，在应用上要受同种属的限制； ②SPA的结合力强，相当于游离抗体与抗原的结合力，对人和兔的亲和常数均为103 L/克分子，结合后对IgG的活性无影响。无论在0℃、37℃、44℃及56℃几乎均能立即结合而无需长时间的孵育，因此可以缩短试验时间，第二抗体在较长的孵育中，出现抗原分解的问题也可以得到解决； ③SPA容易标上125 I、荧光素、辣根过氧化物酶、铁蛋白等，因此可与多种技术相结合； ④在检查细胞上的病毒抗原时，第二抗体往往特异性不强，会非特异性地与细胞膜上的Fc受体结合。SPA分子高度均一，它不是免疫球蛋白，不受Fc受体影响，所以有较高的抗Ig