生物化学技术原理总复习素材.ppt

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根据用途还可以把生物芯片分为两类: 信息生物芯片(information-biochip) 功能生物芯片(function-biochip) 基因芯片技术的概念 基因芯片(Gene chip)技术是指通过微阵列(Microarray)技术将高密度DNA片段阵列通过高速机器人或原位合成方式以一定的顺序或排列方式使其附着在如玻片等固相表面,以荧光标记的DNA探针,借助碱基互补杂交原理,进行大量的基因表达及监测等方面研究的最新革命性技术。基因芯片又称DNA芯片或DNA微阵列。 第一节 基因芯片 一、基本原理 基因芯片的工作原理与经典的核酸分子杂交方法(southern?、northern)相似。 核酸印迹:将待测样品DNA(靶基因)固定于支持物上,用已知序列DNA片段制作探针,二者按碱基互补配对原理杂交,检测出欲鉴定的基因。 基因芯片:将大量已知基因片段以微阵列方式固定在支持物上,待测样品用荧光标记成探针,当探针与芯片上的靶基因杂交后,通过信号检测进行定性定量分析。 基因芯片在一微小的基片表面集成了大量的DNA分子,能够在同一时间内平行分析大量的基因,进行大信息量的筛选与检测分析。 固定于载体上的蛋白质样品(靶蛋白)以阵列方式构成,待测样品用荧光染料或同位素标记制备成探针与芯片杂交,杂交信号用激光扫描仪或放射自显影检测及计算机分析检测结果。 蛋白质芯片适合于蛋白质-蛋白质、蛋白质-核酸(DNA、RNA)、蛋白质-小分子之间的相互作用分析;适合功能基因组、蛋白组研究。 第二节 蛋白质芯片 第十二章 电泳技术 (Electrophoresis, EP) 带电颗粒在电场作用下,由于所带电荷及颗粒形状大小等不同,向与其电性相反的电极移动的速度不同,从而达到分离目的一种方法称为电泳。 电泳技术已被广泛应用于蛋白质、核酸和氨基酸等物质的分离鉴定。 第一节 电泳基本原理 在一定pH条件下,每种分子都具有特定的电荷、大小和形状,在一定时间内它们在相同电场中泳动速度不同,各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。这就是带电粒子可以用电泳技术进行分离、分析和鉴定的基本原理。 第一节 电泳基本原理 带电颗粒在电场中泳动的速度称迁移率或泳动度。 电泳时,带电颗粒在介质中受力平衡匀速运动 则: v = FE/f = F阻/f = E·q/f = E·q/(6π·r·η) E — 电场强度 q — 颗粒所带电荷 r — 颗粒半径 η — 介质黏度 v — 泳动度 F阻 — 颗粒所受阻力 FE — 颗粒所受电场力 f — 摩擦系数 可见泳动度与颗粒所带电荷、颗粒半径、介质黏度以及电场强度有关。 泳动度 染色后,量出指示剂移动的距离和酶带移动的距离。 Rf= 谱带迁移距离 / 指示剂迁移距离 相对迁移率(Rf) 测量迁移率时,应以谱带的中部位置为准; 电泳时多种因素会影响带电颗粒的迁移速度。为了使试验重复性好,这些因子都应尽可能保持恒定。 第一节 电泳基本原理 1. 电场强度:电场强度越高,则带电颗粒泳动越快。 2. 溶液pH 溶液pH值决定带电颗粒的解离程度,亦即决定其所带电荷的多少。 对蛋白质而言,溶液pH值离等电点越远,则颗粒所带净电荷越多,泳动速度也越快;反之,则越慢。 3. 溶液的离子强度 缓冲液离子强度越高,则颗粒的电动电势越小,泳动度越小。一般最适合的离子强度在0.02-0.2之间。 第一节 电泳基本原理 影响泳动度的因素: 第一节 电泳基本原理 影响泳动度的因素: 4. 电渗 电泳缓冲液相对于固体支持物的移动称电渗。 如纸电泳时,滤纸吸附OH- 离子带负电荷,与纸接触的缓冲液带正电荷向负极移动,会对颗粒的移动造成不良影响,故电泳时,电渗小些为好。 5. 温度/焦耳热: 电泳时会生热,使介质粘度下降,分子运动加快,迁移率增加,同时温度过高会使样品中的生物大分子变性失活,因此电泳时,要控制电压或电流,或安装冷却散热装置。 6.支持物: 支持物性质不同也会影响泳动速率,如琼脂、聚丙烯酰胺凝胶都有大小不同的筛孔,在筛孔大的凝胶中溶质颗粒的泳动速率快,反之则慢。 4. 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳对核酸的分离作用主要依据它们的相对分子质量及分子构型,以及凝胶的浓度。 核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系 DNA分子的大小: 琼脂糖的浓度: 电泳 在低浓度、低电压下,分离效果较好。 温度对于DNA在琼脂糖凝胶中的电泳行为没有显著的影响。通常在室温下进行电泳,只有当凝胶浓度低于0.5%时,为增加凝胶硬度,可在4℃,进行电泳。 5. 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂甲叉双丙烯

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