根霉曲的制備杨从举104120300.docVIP

本科学生综合性实验报告 学号 104120300 姓名 杨从举 学院 生命科学学院 专业、班级10 应用生物教育B班 实验课程名称 发酵工程学实验 教师及职称 唐湘华 （实验师） 开课学期 2012 至 2013 学年 下 学期 云南师范大学教务处编印 一、实验设计方案 实验序号： 1、2 实验名称：根霉曲的制备及糖化能力的测定 实验时间：2013年3月20日、3月27日 实验室：学院123 1、实验目的: 掌握固体发酵的基本操作步骤； 了解根霉曲制作工艺和基本原理； 了解糖化酶的测定方法； 对糖化酶的糖化产物及糖化DE的计算； 了解根霉曲在发酵生产过程中主要应用依据。 2、实验原理 固体发酵的一般流程 保藏菌种 原料 斜面活化 预处理 固体三角瓶培养 蒸料 固体浅盘培养 冷却 接种 接种 培养 通过固体发酵，根霉在麦麸培养基中进行大量繁殖，产生淀粉酶和糖化酶复合酶系； 通过淀粉酶的液化和糖化酶的糖化作用将淀粉转化为还原单糖。 淀粉是由葡萄糖通过α-1,4糖苷键构成的直、链淀粉和α-1,6位有分支的支链淀粉组成的，直链淀粉约含100-6000个葡萄糖单位，支链淀粉平均含6000个以上的葡萄糖单位，最高可达300万。 淀粉酶首先酶解淀粉为小分子的糊精、寡糖和少量单糖； 通过糖化酶的作用将小分子的糊精和寡糖降低为还原性的单糖。 3、实验器材、材料 1．器材 天平、烧杯、三角瓶、灭菌锅、超净工作台、培养箱水浴锅、离心机、722分光光度计、移液枪等。 2．材料　 麦麸、 根霉AS3.866、自来水柠檬酸缓冲液、DNS、1%淀粉。 4、实验步骤 根霉曲的制备： （1）、培养基的配制与灭菌（约60%含水量） 麦麸20g＋20ml水 /人 → 放入烧杯拌匀（以组为单位）→ 分装于三角瓶→包上纱布（至少6层）→包牛皮纸（一层）→包 扎→120℃灭菌1h 摇动打散瓶内培养基→冷却至约30℃ （2）、接种（ AS3.866 ） 液体接种，接种量5% →无菌操作进行接种→摇匀→在瓶壁上写上姓名、接种日期 （3）、培养 接种后的三角瓶倾斜平放 → 28℃培养24h → 扣瓶 （本周四） → 继续培养约24~48h → 出料（烘干、磨碎） → 根霉曲 酶液的制备： 取1克根霉曲溶解到10毫升缓冲液中，混合搅拌10分钟，纱布过滤，取过滤液备用。 绘制标准曲线的方法： 先配制一系列浓度不同的标准溶液，用选定的显色剂进行显色，在一定波长下分别测定它们的吸光度A。 以A为横坐标，浓度c为纵坐标，则得到一条拟合度较好的直线，称为标准曲线。然后使用用完全相同的方法和步骤测定被测溶液的吸光度，便可从标准曲线上找出对应的被测溶液浓度或含量。 0.1%葡萄糖标准曲线的制作 取7支试管，编号，按照下表进行操作： 葡萄糖溶液体积（ml） 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 葡萄糖含量（㎎） 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 缓冲液（ml） 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 DNS (ml) 3 3 3 3 3 3 3 定容总体积(ml) 15 15 15 15 15 15 15 OD（540nm） 糖化酶酶活测定： 取酶液按照下表要求操作测定酶活； 操作步骤 空白管 样品管A 样品管B 步骤1 吸取1.8mL淀粉底物溶液 吸取1.8mL淀粉底物溶液 吸取1.8mL淀粉底物溶液 步骤2 50℃保温5分钟 50℃保温5分钟 50℃保温5分钟 步骤3 加入待测酶液0.2毫升 加入待测酶液0.2毫升 步骤4 50℃精确保温10min 50℃精确保温10mi