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微生物学大实验 ----植物内生真菌的分离 学院：生命科学学院 年级：2013级 班级：生物技术2班 姓名：李丹 学号植物内生真菌的分离 植物内生菌( Endophyte) 是指那些在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物的各种组织和器官内部的真菌或细菌，而宿主植物一般不表现出外在的症状。 实验目的 了解微生物存在的普遍性和多样性 掌握常规的微生物分离纯化方法 培养实验创新能力 实验材料 健康无病虫害的植物例如山茱萸或其它植物的(根)、茎、叶 试剂：次氯酸钠(或双氧水或氯化汞）、无水乙醇、葡萄糖、琼脂、青霉素、链霉素 培养基：PDA培养基、分离培养基 实验步骤 配制PDA培养基 配制分离培养基 采集新鲜植物的根、茎、叶、果实 植物组织表面消毒 接种 分离与纯化 菌种保藏 PDA配制方法 土豆200g，去皮切小块，煮沸30min，4层纱布过滤，滤液加热，加入琼脂15克，琼脂完全融化后加入葡萄糖20g，待稍冷却后加水至1升即可。 分离培养基的配制 灭菌后的培养基加入青霉素100mg／L、链霉素200mg／L即可 植物组织表面消毒的方法 将新鲜、健康的板蓝根（山茱萸或女贞）的根、茎、叶于自来水下冲洗干净，沥干表面水分后剪成小段（片）做如下表面消毒处理： 75%酒精漂洗3min，无菌水冲洗4~5次，5%次氯酸钠溶液漂洗叶2-3min、茎5-7min、根5-7min，无菌水冲洗4~5次，无菌滤纸吸干水分。 将上述表面消毒后的材料剪切成 0.5cm2 小块，放入含有分离培养基的平板中（4块／每板）28℃恒温培养3~10天，待组织块边缘长出菌丝后及时挑取，将其转入另一PDA平板培养，重复操作直至纯化，4 ℃ 斜面保存。 对照：（设置两个） (1)最后一次表面消毒的无菌水，移接至PDA平板。 （2）消毒后的植物组织，在PDA分离平板上轻轻按压即为印记平板对照。 注意事项 注意消毒时间，设计对照组，检验表面消毒是否彻底。 做印记对照时，要用完整的组织材料在平板上轻轻按压即可。 思考题 表面消毒时间过长或过短会出现什么问题？ 实验中为什么设置对照组？ 怎样能够尽可能多的分离植物内生真菌？ 分析内生真菌分离不完全的原因。