桃紅四物汤乙醇提取液体外抗羟自由基作用的研究.docVIP

桃红四物汤乙醇提取液体外抗羟自由基作用的研究▲ 摘 要 目的：研究桃红四物汤的乙醇提取液的抗羟自由基的活性。方法：采用分光光度法, 对桃红四物汤醇提液体外抗羟自由基活性进行测定。邻二氮菲与Fe2+反应形成红色配合物, H2O2和Fe2+产生? OH，加入抗羟自由基的物质后，减弱了? OH对Fe2+/邻二氮菲的氧化作用，引起吸光度变化，本实验使用721型分光光度计,在510 nm处测定其吸光度值,根据吸光度的变化值间接测定其抗羟自由基能力，并以没食子酸作为阳性对照。结果：桃红四物汤乙醇提取液对羟自由基清除率达到50 %时所需药物的终浓度（IC50）为14.9±0.4μg /mL。结论：桃红四物汤醇提液对羟自由基具有清除作用,与对照组比较,作用弱于相同剂量的没食子酸。 关键词：桃红四物汤；分光光度法；抗羟自由基 桃红四物汤出自《医宗金鉴》，由桃仁、红花、当归、川芎、熟地、白芍组成。桃红四物汤在预防动脉粥样硬化和改善心血管疾病方面具有一定作用[1]，可能与抗氧化作用有关，因此，研究桃红四物汤的抗氧化活性具有一定意义。在众多的自由基中，羟自由基是最活泼的，其反应速度极快，它是对机体危害最大的自由基，超过了其它氧自由基[2]，所以本实验进行桃红四物汤醇提液体外抗羟自由基的实验研究。清除羟基自由基的测定方法很多，目前多采用邻二氮菲-金属铁离子-H2O2 体系 [3-5]。 本文通过检测桃红四物汤醇提液体外抗羟自由基的活性，为桃红四物汤抗氧化产品的开发，研究提供相关依据，对进一步地阐明该方的药效物质基础具有重要意义。 材料与方法 1 仪器和试剂 1.1中药材 红花、桃仁、当归、川芎、熟地、白芍，购自张垣中药饮片有限公司 1.2主要试剂 无水乙醇 天津市大茂化学试剂厂 邻二氮菲 批号2002年1 硫酸亚铁 批号 2003年3 磷酸氢二钠 批号200208-3 北京市红圣化工厂 磷酸二氢钾 批号910821 天津市化工试剂六厂 H2O2 天津市东方化工厂 没食子酸 批号：110831-200302 中国药品生物制品鉴定所。 1.3主要仪器 索氏提取器，电光分析天平TG-328A型（上海天平仪器厂），微量分析天平TG-322A（上海天平仪器厂），电热恒温水槽DK-8B型（上海精宏实验设备有限公司），微电脑智能化控制新型电热恒温鼓风干燥箱DHG-9070AS（宁波江南仪器厂），721型可见分光光度计（上海精密科学仪器有限公司） 2 方法 2.1 实验原理 根据文献[6]，邻二氮菲与Fe2+反应生成红色配合物 H2O2 + Fe2+→HO·+ HO- + Fe3+ 具有抗羟自由基能力的物质能抑制上述反应的发生，加入抗羟自由基的物质后，减弱了? OH对Fe2+/邻二氮菲的氧化作用，引起吸光度变化，本实验利用分光光度法测定其样品吸光度值的改变值来间接测定桃红四物汤的抗羟自由基能力。 2.2桃红四物汤乙醇提取液的制备 精密称取桃红四物汤5 g，石油醚脱脂后，用75％的乙醇 2 h，滤液常压浓缩定容至50.0 mL备用。 2.3 试液的制备 2.3.1没食子酸溶液的制备 精密称取11.14 mg的没食子酸，加水溶解，室温冷却，定容至100 mL容量瓶中，得浓度为0.1114 mg／mL的储备溶液。使用时将储备液分别 稀释20倍、25倍、35倍、50倍、100倍。 2.3.2 称取14.3 g的Na2HPO4·12H2O，加水溶解，室温冷却，定容至200 mL容量瓶中，得浓度为0.2 mol/L的溶液；称取2.7 g的KH2PO4，加水溶解，室温冷却，定容至100 mL容量瓶中，得浓度为0.2 mol/L的溶液。配制时取81 mL的Na2HPO4溶液，19 mL的KH2PO4溶液，混合均匀，即得PH 2.3.3 精密称取0.1489 g的邻二氮菲，加水溶解，室温冷却，定容至200 mL容量瓶中，得浓度为3.8× 10-3 2.3.4 精密称取0.2084 g的FeSO4·7H2O，加稀盐酸溶液溶解，室温冷却，加蒸馏水定容至100 mL容量瓶中，得浓度为7.5× 10-3 mol/L的储备液，实验时，将储备液稀释 2.3.5 H2O2 精确量取30 %的H2O2溶液0.25 mL，室温下定容至25mL的容量瓶中，得0.3 %的H2O2储备液，实验时，将储备液稀释为0.1 %的溶液使用。 2.4 羟自由基清除率测定波长的选择 根据实验原理，羟自由基清除率的测定实际上就是根据测定邻二氮菲-Fe2+ 溶液的吸光度值来间接测定样品的抗羟自由基能力。 在721型分光光度计上，用0.5 cm比色皿以蒸馏水为参比溶液，在480 nm-540 nm之