酶的專一性及影响酶促反应的因素.docVIP

实验二 酶的专一性及影响酶促反应的因素 一 实验目的 通过本实验，证明酶对底物催化的专一性，以及PH、温度、激活剂、抵制剂对酶促反应速度的影响。 二 实验原理 唾液淀粉酶能专一的催化淀粉水解，生成一系列水解产物，即糊精、麦芽糖、葡萄糖等。麦芽糖或葡萄糖都属于还原糖，能使班氏试剂中的二价铜离子还原成亚铜，并生成砖红色的氧化亚铜。淀粉酶不能催化蔗糖水解，且蔗糖本身不是还原糖，所以不能与班氏试剂作用呈色。以此证明酶催化底物的专一性。 淀粉或淀粉的水解产物遇碘会呈现不同的颜色，淀粉遇碘变蓝色；糊精遇碘则根据其分子量的大小依次呈现紫色、褐色、红色；而麦芽糖、葡萄糖遇碘不呈色。通过颜色变化可以了解淀粉的程度，以观察PH、温度激活剂、抑制剂对酶促反应速度的影响。 三 药品器材 试管、试管夹、样品杯、滴瓶、温度计、恒温水浴箱，冰箱等。 1.1%淀粉溶液 称取可溶性淀粉1g，加5ml蒸馏水调成糊状，徐徐倒入80ml煮沸的蒸馏水中，不断搅拌，待其溶解后，加蒸馏水至100ml。此液应新鲜配制，防止细菌污染。 2．1%蔗糖溶液 称1g蔗糖，加蒸馏水至100ml溶解。 3．PH6.8缓冲液 取0.2mol/L磷酸氢二钠溶液154.5ml，0.1mol/L柠檬酸溶液45.5ml混合即可。 4．PH4.8缓冲液 取0.2mol/L磷酸氢二钠溶液98.6ml，0.1mol/L柠檬酸溶液101.4ml混合即可。 5．PH8.0缓冲液 取0.2mol/L磷酸氢二钠溶液194.5ml，0.1mol/L柠檬酸溶液5.5ml混合即可。 6．班氏试剂 溶解结晶硫酸铜17.3g于100ml热的蒸馏水中，冷却后加水至150ml为A液。取柠檬酸钠173g和无水碳酸钠100g，加蒸馏水600ml?,加热溶解，冷却后加水至850ml为B液。将A液缓慢倒入B液中，混合即可。 7．稀碘液 称取碘1g，碘化钾2g ,溶于300ml蒸馏水中。 8．0．9%NaCl溶液。 9．0．9%CuSO4溶液。 10．0．1%Na2SO4溶液。 11．稀释唾液 用清水漱口，清除食物残渣。再含蒸馏水30ml作咀嚼运动，2分钟后将稀释唾液收集于样品杯中备用。 四 实验方法 酶的专一性 取二支试管，编号，按下表操作。 加入物（滴） 1号管 2号管 PH6.8缓冲液 20 20 1%淀粉溶液 10 — 1%蔗糖溶液 — 10 稀释唾液 5 5 将各管混匀，置37度水浴箱保温10分钟后取出 班氏试剂 15 15 将各管混匀，置煮沸水浴箱煮沸3~5分钟，观察结果 PH对酶促反应速度的影响 取三支试管，编号，按下表操作。 加入物（滴） 1号管 2号管 3号管 PH4.8缓冲液 20 — — PH6.8缓冲液 — 20 — PH8.0缓冲液 — — 20 1%淀粉溶液 10 10 10 稀释唾液 5 5 5 将各管混匀，置37度水浴箱保温5~10分钟后取出 稀碘液 1 1 1 观察各管的颜色 3.温度对酶促反应速度的影响 取三支试管，编号，按下表操作。 加入物（滴） 1号管 2号管 3号管 PH6.8缓冲液 20 20 20 1%淀粉溶液 10 10 10 将1、2、3号管分别置于0℃、37℃、100℃ 稀释唾液 5 5 5 继续将1、2、3号管分别置于0℃、37℃、100℃ 稀碘液 1 1 1 观察各管的颜色 激活剂、抵制剂对酶促反应速度的影响 取四支试管，编号，按下表操作。 加入物（滴） 1号管 2号管 3号管 4号管 PH6.8缓冲液 20 20 20 20 10 10 10 10 10 蒸馏水 10 — — — 0．9%NaCl — 10 — — 0．9%CuSO4 — — 10 — 0．1%Na2SO4 — — — 10 稀释唾液 5 5 5 5 将各管混匀，置37℃水浴箱保温5~10 稀碘液 1 1 1 1 观察各管的颜色 五 注意事项 唾液淀粉酶的活性存在个体差异，同时受唾液稀释倍数影响，收集唾液时应事先确定稀释倍数，或收集2~4人的混合唾液。 酶促反应的保温时间，直接影响本实验的效果。根据各实验条件通过预试，确定最佳保温时间。 六 思考题 结合本实验说明PH、温度、激活剂、抵制剂对酶促反应速度的影响。