2015酶工程第4章 酶和细胞的固定化.ppt

酶工程手册p410 酶工程手册p401 * 酶工程手册p402 * * 传统固定化方法的比较 特征 载体结合法 交联法 包埋法 离子吸附法 物理吸附法 共价结合法 制备 易 易 难 中 较难 结合力 中 弱 强 强 强 酶活性 高 高 中或低 低 高 载体再生性 较容易 容易 难 不能再生 不能再生 底物专一性 不变 不变 可变 可变 不变 稳定性 中 低 高 高 高 固定化成本 低 低 高 中 中或高 抗微生物能力 无 无 无 可能 较强 (5) 非传统固定化方法 修饰-吸附法 如：单甲氧基PEG(1900)以NPCF（氯甲酸对硝基 苯酯）活化，使玫瑰假丝酵母脂酶PEG化，增加酶活。 To：酶难以吸附在载体，或吸附量低 吸附-包埋法 如：两步法来自放线菌的青霉素V酰基转移酶固定： a. 酶吸附于硅藻土，b. 包埋于聚丙烯酰胺凝胶 如：来自黑曲霉的葡糖淀粉酶固定化（可稳定21天）： a. 吸附于糊化的玉米淀粉上，b.包埋于藻酸盐纤维中。 To：酶容易从载体表面脱离 吸附-交联法 如：青霉素G酰基转移酶吸附固定在壳聚糖、琼脂糖、苯氧乙酰纤维素、聚丙烯酰胺泡沫塑料、多孔玻璃等不同载体上，再用戊二醛交联。在60℃下稳定性比自由酶提高10倍以上。 To：酶容易流失，稳定性差 4mL 碱性蛋白酶液 离子交换树脂 Dower MWA-1 1g, 用多种缓冲液洗涤 pH 6.5 1%戊二醛溶液 活力回收率27% 过滤， 磷酸钾缓冲液洗涤 吸附交联法固定 碱性蛋白酶 0 ℃，1h 修饰-包埋法 酶先共价结合明胶、水溶性右旋糖酐、淀粉等，所得共轭物再被包埋进凝胶基质中。 如：天然牛血清胺氧化酶PEG化，再与水凝胶作用 To：包埋酶流失 修饰后固定化 额外电荷的引入 氨基酸残基的互换 疏水性的改变 不饱和键的引入 提高有机溶剂中溶解度 环节支持物表面的毒性 如：疏水的酰亚胺酯修饰酵母醇脱氢酶，可定量吸附在XAD-7多聚体小珠上。 固定化酶化学后处理 如：固定在CNBr活化琼脂糖上的黑曲霉的β-葡萄糖苷酶的热稳定性，在经该酶的糖链氨烷化后，借助戊二醛的交联，得到明显改进。 4.3 固定化酶的性质 Properties 固定化酶 活力 固定化酶 稳定性 固定化酶 底物特异性 最适温度 最适pH值 固定化酶的活力 固定化酶活力 一般低于天然酶 固定化载体与酶的相互作用引起酶活性中心或调解中心的构象发生了改变，甚至影响了活性中心的氨基酸，从而导致酶活力下降； 固定化载体增加了酶分子的活性中心与反应底物之间的阻力（载体空隙太小或固定化方式与位置不当），使得底物无法和酶接触，影响对底物的定位作用，从而降低酶活力； 固定化酶的稳定性 固定化后酶分子与载体 多点连接，防止酶分子 伸展变形；酶分子失去了 分子间相互作用的机会， 抑制了降解，提高了酶的稳定性，保存时间延长。 固定化酶稳定性（热稳定性、储存稳定性、操作稳定性）一般高于天然酶 c. 影响因素：交联剂、介质、温度，pH，离子强度，缓冲液种类，添加剂等 b. 对蛋白酶抵抗性增强，对变性剂（如尿素、有机溶剂、盐酸胍等）耐受性提高，保留较高酶活力；对酶抑制剂、对不同 pH 值的稳定性提高 固定化酶的底物特异性 固定化酶的底物特异性与底物分子量的大小有关。 作用于低分子量底物的酶，特异性无明显变化（如氨基酰化酶、葡萄糖氧化酶等）。 c. 既可作用于大分子底物，又可作用于小分子底物的酶，特异性往往会发生变化。 例：固定在羧甲基纤维素上的胰蛋白酶，对二肽或多肽的作用保持不变，而对酶蛋白的降解活力仅为游离酶的 3% 左右 原因：载体的空间位阻作用，大分子底物难于接近酶分子 固定化酶的最适温度 与游离酶相比，固定化酶的最适温度一般变化不大，部分酶固定化后最适温度发生明显变化。 例1：利用重氮化法制备固定化胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，最适温度比游离酶高出 5～10摄氏度。 例2：色氨酸酶与载体共价结合之后，最适温度比游离酶高 5～15摄氏度。 b. 不同方法固定化同一种酶，最适温度可能不同。 例：氨基酰化酶（游离酶最适 60 摄氏度） i 用 DEAE-葡聚糖凝胶为离子结合载体得到的固定化酶最适温度为 72 摄氏度； ii 用 DEAE-纤维素结合后，最适温度为 67摄氏度； Iii 用烷基化共价结合后，最适温度比游离酶有所下降。 固定化酶的最适pH值 酶固定化后最适 pH 值一般会发生变化，主要取决于固定化酶所处的微环境的性质 b. 载体性质的影响 带负电载体：最适 pH ? 带正电载体：最适 pH ? c. 产物性质的影响 酸性产物：最适 pH ? 碱性产物：最适 pH ? 4.4 应用实例 Examples：甜