分子生物学实验简述.doc

7? 繁殖迅速，培养对象易于控制，利用DNA重组技术构建大肠杆菌工程菌大规模生产真核生物基因尤其是人类基因的表达产物，具有重大的经济价值。目前已实现商品化的30多种基因工程产品中，大部分是由大肠杆菌生产的。?2.3.3?pBR322质粒载体的特点? （1）具有较小的分子量，避免在DNA的纯化过程中发生链的断裂,pBR322质粒这种小分子量的特点，不仅易于自身DNA的纯化，而且可容纳较大的外源DNA片段? （2）具有两种抗菌素抗性基因(四环素、氨苄青霉素抗性基因)可供作转化子的选择记号，能指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞以及外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子,便于分子克隆的筛选。? （3）含有高效的自主复制成分，质粒的复制和宿主的繁殖不相关，在抑制细菌蛋白质合??????成时，细菌染色体DNA?停止复制，但质粒可以继续利用细菌原有的酶系统进行复制。?（4）限制性内切酶单一切口，在质粒复制子以外的部位具有一种或多种限制性内切酶的单一切口，便于外源基因的插入。? 2.4基因的导入? 2.4.1基因导入的概述? 把已知基因转移到真核细胞，并且整合到基因组中得到稳定表达的技术，称为基因导入。它是改变物种遗传性状的最根本途径。要把基因导入细胞，首先要把细胞克隆化。目前已经得到了若干真核细胞克隆化基因，如β-珠蛋白基因，TK基因等。利用显微镜操作把这些基因注入到小鼠受精卵的原核中，再把受精卵植入到生殖管道中，发育成的个体不仅能表达注入 8? 基因决定的性状，而且能把该基因传到第二代。?2.4.2基因导入的方法? ?????基因导入的方法总体有物理方法，化学方法和生物学方法。其中物理方法主要有DNA直接注射法、颗粒轰击技术;化学方法主要有脂质体载体、受体介导法；生物学方法主要通过构建病毒载体来完成，常见的有逆转录病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒等。? 2.5基因的导入后的筛选与鉴定? 2.5.1筛选与鉴定的原因? ?????由于DNA分子的体外重组是分子群体间的反应，因此连接反应完成后的体系中不仅含有正确的重组子，还含有一些不正确的重组子及为重组的DNA，如载体自身环化形成的DNA分子，外源DNA片段彼此相连形成的多聚物等。因此，连接物转化受体细胞后，我们需要采用适当的方法将所需要的目的基因转化重组子从非重组子中和细胞群体中筛选和鉴定出来。重组子的筛选与鉴定是基因克隆的重要步骤。?2.5.2筛选与鉴定的方法? ????筛选与鉴定的方法，在遗传选检测上有插入失活筛选、蓝白斑筛选；在物理检测上有酶切鉴定、PCR检测；此外还可利用核酸分子杂交检测，免疫学检测，核酸序列分析等方法。? 2.6目的基因的表达与鉴定? 2.6.1目的基因表达与鉴定的原因? ????克隆的基因只有通过表达才能探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理，克隆基因表达出所编码的蛋白质可供做结构与功能的研究。有些具有特定生物活性的蛋白质在医学上以至在工业上都是很有应用价值的，可以克隆其基因使之在宿主细胞中大量表达而获得。?2.6.2目的基因的表达系统与鉴定方法??迄今为止，已建立的基因表达系统有多种，包括原核生物表达系统和真核生物表达系统。常用的原核生物表达系统有大肠杆菌表达系统，芽孢杆菌表达系统和链霉菌表达系统等；常用的真核生物表达系统是酵母表达系统、哺乳动物细胞表达系统和昆虫细胞表达系统等。而其中最具代表性的是大肠杆菌表达系统和酵母菌表达系统。? 目的蛋白的鉴定方法包括生化反应检测法，免疫学检测法和生物学活性检测法等。常用的有SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、Western杂交、等点聚焦电泳和双向电泳等。? 3、基因工程生产干扰素? 3.1、干扰素目的基因的分离与扩增? (1)破碎细胞，用Trizol法提取总的RNA?????? ?(2)将生产干扰素的人白细胞的mRNA分级分离然后进行凝胶电泳切取相对分子质量为256bp的部分? ?(3)mRNA反转录成cDNA? cDNA第一链的合成（Reverse?Transcription）。? ????选用GIBICOL公司提供的SuperScriptTM?Preamplification?System?for?First?Strand?cDNA?Synthesis?试剂盒使用Oligo(dT)引物（因为Oligo(dT)与mRNA的Poly(A)尾巴可以发生特异性结合，所以用Oligo(dT)特异结合到mRNA上Poly(A)尾端，以此可以特异地将mRNA从总RNA中分离出来。属于亲和层析技术。）? 在0.5ml微量离心管中，加入总RNA?1-5μg，补充适量的DEPC?H2O使总体积达11μl。在管中加10μM?Oligo（dT）12