第四章液相色谱法.doc

第四章 高效液相色谱法 对沸点高，相对分子量较大，受热易分解的有机化合物、生物活性物质及多种天然产物（约占全部有机物的80%）的分离分析，液相色谱比气相色谱适用。 相比于气相色谱，液相色谱的优点如下： ①分离效能高。液相色谱柱效可达30000块/m，气相色谱为2000块/m。 ②检测灵敏度高。最小检测量可达10-9克，荧光检测器甚至能达10-11克。 ③分析速度快。高压输液泵，输液压力可达40Mpa，流速可达1-10ml/min。 ④选择性高。 液-固吸附色谱的分离原理：基于固定相对各组分吸附能力的差异进行混合物的分离。 固定相为固定吸附剂，可分为极性和非极性。 对流动相的要求：溶剂与固定相互不相溶，并能保持色谱柱的稳定性；高纯度；与使用的检测器相匹配；对样品有足够的溶解能力；应有低的粘度和适当低的沸点；应尽量避免使用有显著毒性的溶剂，保证安全；成本要低。 4.1HPLC主要类型及其选择 HPLC主要类型有：化学键合相色谱法；液固色谱法；离子对色谱法；离子色谱法；体积排阻色谱法。而化学键合相色谱法又分为正相色谱和反相色谱： 正相键合相色谱法(Normal phase chromatography)：固定相的极性大于流动相的极性，适用于分离油溶性或水溶性的极性或强极性化合物。 反相键合相色谱法(Reversed phase chromatography)：固定相的极性小于流动相的极性，适于分离非极性、极性和离子性化合物。应用最广泛。 固定相极性 流动相极性 组分洗脱次序 正相色谱法 高～中 低～中 极性小先洗出 反相色谱法 中～低 中～高 极性大先洗出 类型 分离方式 应用特点 C-18 反相、离子对 普适性好，保留值大。溶于水的高极性化合物、中等极性化合物 C-8 反相、离子对 与C-18类似，保留值略小 C-3,C-4 反相 保留值小，适合肽类和蛋白质 苯基 反相 保留适中，选择性不同。非极性、中等极性化合物 -CN 反相、正相 选择性与硅胶类似，保留小，用途广 -NH2 反相、正相、离子交换 分离糖类、核苷酸、固醇等 二醇基 正相 分离有机酸、排阻分蛋白质等 醚基 反相、正相 分离酚类、芳硝基化合物，保留比C-18强 聚苯乙烯基 反相 PH使用范围广，对部分分离峰形好，寿命长 4.2高效液相色谱仪 高效液相色谱仪的主要部件有：贮液罐、高压输液泵、进样系统、色谱柱、检测器、数据处理装置。 4.2.1高压输液系统 ①贮液罐：提供足够数量的符合要求的流动相。 要求：有足够的体积，以备重复分析时保证供液量，容积一般为0.5-2L；脱气方便；能耐一定压力；所选用的材质对所使用的溶剂都是惰性的。 所有溶剂在放入贮液罐之前必须经0.45μm滤膜过滤，以除去溶剂中的机械杂质，防止输液管道或进样阀堵塞。经滤膜过滤后还需脱气。 ②高压输油泵：将流动相以稳定的流速或压力输送到色谱分离系统。 要求：泵体能耐化学腐蚀；能在高压下工作；输出流量稳定，无脉冲，重复性高，输出流量范围宽；适用于梯度洗脱。 类型：恒流泵，恒压泵（通常用往复式恒流泵） ③过滤器:除去机械杂质。 在高压输液泵的进口及进样阀前，应放置过滤器。 过滤器的滤芯是用不锈钢烧结构材料制造，孔径2-3μm，耐有机溶剂的侵蚀。若发生过滤器堵塞（发生流量减少的现象），可将其浸入稀HNO3溶液中，在超声波清洗器中用超声波震荡10-15min，即可清洗干净。若清洗后仍达不到要求，则更换滤芯。 4.2.2进样系统 进样器：将样品溶液准确送入色谱柱。 要求：密封性好，死体积小，重复性好，进样引起色谱分离系统的压力和流量波动要小。 取样时，流动相直接进柱，进样口与定量环连接，样品充满定量环后，多余样品流出。 进样时，泵将流动相压入定量环，将样品全部携带进入色谱柱分析。 4.2.3色谱柱：担负分离任务 要求：柱效高，选择性好，分析速度快。 色谱柱是色谱仪的心脏（起分离作用），其核心是优质的固定相（填料）。进行色谱分离的首要工作是选择性能良好和适宜的色谱柱，即在确定的分离条件下分离效率高和分析时间短的色谱柱。 色谱柱的选择应考虑：固定相类型的选择, 主要取决于样品及其分离模式；柱填料的结构, 主要指颗粒的形状大小、均匀性、比表面、平均孔径和孔容等；柱规格指柱内径、柱长度和填料粒度。 色谱柱的分离效率（简称柱效），可定量地用理论塔板数N来表示。 4.2.4检测器：对分离出的组分进行分析。 检测器(detector)的主要性能要求：灵敏度（sensitivity）高（检测限低）；噪音（noise）低；线性范围（linear range）宽；重复性（repeatability）好；适用范围广（通用型、专属型）。 4.2.5色谱工作站：把模拟