基因工程4-目的基因的分离和获得及重组基因的导入(中国药科大学生物5工程所有课件).pptVIP

我国科学家周光宇在1983年首次在“Methods in En-zymology”报道的研究成果。 现该技术主要在蔬菜育种上应用。（白菜、茄子、黄瓜、番茄、辣椒等 操作步骤: 1.外源DNA的制备 2. 分析受体植物的受精过程及时间，确定导入外源DNA的时间方法（3种） 柱头涂抹法 柱头切除法 花粉粒吸入法 3.后代材料处理 8. 超声波介导转化法 （1）原理：利用低音强脉冲超声波的物理作用，可逆性的击穿细胞膜并形成过膜通道，使外源DNA 进入受体细胞。 （2）特点：避免脉冲变电压对细胞的损伤，有利于细胞存活整个操作转化率较高，如在转化反应中加入DMSO或携带DNA则转化率更高。60-70% （3）适用范围：微生物、植物 过程: 无菌材料的制备 质粒DNA的提取 超声波缓冲液配置 超声波处理（去无菌材料切成小块，放入无菌超声波小室，同时加入5%DMSO缓冲液，质粒DNA 20ug/ml及鲑鱼精DNA 40ug/ml，室温下超声波处理30min） 处理后用缓冲液洗3次 接种在MS或其他培养基上培养 9. 激光微束穿孔转化法 早在1984年Tao等首先利用激光微束对动物细胞进行DNA转化试验、此庸Web等利用激光微束技术对原生质体、花粉以及活细胞内的叶绿体进行外源DNA导入获得成功，并用荧光标记的大肠杆菌pBR322质粒DNA在转化细胞中得到检测。 （1）原理：利用直径很小、能量很高的激光微束能引起细胞膜可逆性穿孔的原理。在荧光显微镜下找适合的细胞，然后用激光代替荧光光源，聚焦后发出激光微束脉冲，造成膜穿孔外于细胞周围的外源DNA分子随之进入受体细胞。 （2）特点：操作简便快捷，转化效率高10-3-10-4，无宿主限制，但需要贵重仪器，技术条件要求高，稳定性和安全性不如电穿孔法和基因枪法。 （3）适用范围：动植物细胞、组织、器官及线粒体、叶绿体。 过程 1）DNA的提取 2)受体植物样品制备：将欲照射的植物细胞或组织用高渗缓冲液浸泡数分钟，不同作物不同外植体所用高渗液不同，浸泡时间也不同。 3)转导细胞悬浮液准备：激光照射前洗去高渗液，加新鲜培养液。吸取0.5mI细胞悬浮液，加50ul质粒DNA或植物外源DNA(浓度5ug／ml)．一起注入激光微束系统的Rose小室。 4)激光微束照射：激光微束显微照射装置如为Nd—YAG四集倍频脉冲激光冠微照射系统、即输出波长技需要选择，脉宽10-15ns。激光束引入一台相差显微镜，用40ⅹ物镜聚焦Y于欲照射的细胞。光斑直径为1.3nm。照射时移动载物台，使激光脉冲在植物细胞团上进行扫描照射，照射时间每个佯品60分钟，约打7000个脉冲。 5)培养：激光照射后，将样品用新鲜的培养液冲洗1-2次，然后接种在装有液体培养基的小培养皿中，25度条件下悬浮培养2-3天或固体培养。 10. 病毒颗粒转导法 （1）原理：用病毒(噬菌体)DNA(或 RT-DNA)构建的克隆载体或携带目的基因的克隆体，在体外包装成病毒(噬菌体)颗粒后，感染受体细胞，使其携带的重组 DNA 进入受体细胞，将此过程称为病毒(噬菌体)颗粒转导法。 （2）适用范围：主要用于构建基因文库和目的转基因，早期也用于植物的转基因。 （3）类型： 带有目的基因的病毒颗粒直接感染受体细胞，目的基因打随同病毒DNA分子整合到受体细胞染色体DNA上，这样以后不需要再包装成病毒颗粒。 带有目的基因的病毒是缺陷型的，需同另一辅助病毒一起感染受体细胞，在受体细胞内包装成新的病毒颗粒。 虽然带有目的基因的SV40早期转录是缺陷型的，但被感染的cos细胞系的基因组中整合的SV40早期转录区段DNA，所以无需辅助病毒做混合感染。 11. 磷酸钙转染法 （1）原理：哺乳动物细胞能捕获黏附在细胞表面的DNA-磷酸钙沉淀物，使DNA转入细胞。 （2）基本操作过程：将待转染的外源 DNA同CaCl2混合制成CaCl2-DNA溶液，逐滴加入到不断搅拌的Hepers-磷酸钙溶液中，形成DNA-磷酸钙共沉淀复合物；用吸管将沉淀复合物黏附在哺乳动物单层培养细胞表面；保温几小时后，用新鲜培养液洗净细胞，再用新鲜培养茹继续培养，直至外源基因表达。 （3）特点：多使用高浓度的DNA，10~50μg/ml；保温时间随受体细胞而异；Hepers-磷酸钙溶液应不断搅拌，DNA溶液则应缓慢加入，否则形成大块状颗粒，不利于受体细胞吸纳。 （4）适用范围：哺乳动物细胞 12. DEAE-葡聚糖转染法 即二乙胺乙基葡聚糖法 （1）可能机制：①DEAE葡聚糖能与外源DNA形成复合物，保护DNA免受核酸降解② DEAE葡聚糖可作用于受体细胞，增加其通透性，便于DNA进入。 （2）类型：病毒DNA直接与DEAE-葡聚糖混合形成复合物，再处理受体细胞