RT-qPCR操作说书.docVIP

注意事项 以下的Protocol主要适用于（1）所使用的DNA1、反转录酶、RNA 酶抑制剂以及dNTPs均是Fermentas公司的；而在qPCR中，所使用的Supermix是Bio-RAD公司的。 RT-qPCR中的注意事项： MgCl2的浓度2~4mM； 模板的浓度50ng~5pg之间； 引物的浓度，500nM比较合适，若反应效果不好可以在0.1~1uM之间选择； 退火温度的选择，首次设置比实际小5℃的，之后在1~2℃选择； 引物设计的时候Tm值最好在60℃附近，正反向引物的Tm的差值在1~2℃之间； 抽提得到的RNA，需要验证RNA的纯度，最好验证一下RNA的完整性； 在qPCR中，模板的体积要小于总反应体系的10%（主要是模板的加入量会影响反应体系中的MgCl2浓度）； 扩增曲线一定要做。通常如果有条件也要做退火温度梯度，以获得最佳的退火温度。另外就是，一块板子上，尽可能取尽量多的样本，而不是基因； 扩增效率在90~110%的范围内是可以接受的； 内参基因的选择，尽可能选择与靶基因处于同一信号通路中的内参基因。 有关引物设计 扩增子长度小于150bp； 引物Tm的理想值57~60℃； 3’端最后5个碱基里面G或C的含量少于三个； GC含量介于20~80%，理想值40~60%； 避免引物二聚体及自身二级结构； 避免引物内的自身重复序列； 在一个实验中不论是绝对定量还是相对定