第六章 体外分析_培训课件.ppt

* IRMA在实际应用中的特点 标记物的稳定性好：标记的是抗体IgG蛋白分子，含有多个酪氨酸或组氨酸残基，标记方法简单，稳定性好。 反应动力学：非竞争性反应，且抗体是过量的，反应速度快，反应容易达到平衡，温度变化对结果影响不大。 * 灵敏度：理论上比RIA高出10～100倍。但是要求有良好的分离方法的保证。 特异性：由于使用的是单克隆抗体，所以特异性一般比较高。 加样误差：由于抗体是过量的，所以在IRMA的加样误差主要来自抗原一个环节。而RIA的抗体、待测抗原、标记抗原都可能产生加样误差。 * 优点：是非竞争性反应，灵敏度明显高于RIA。 缺点：需要特殊的分离方法。 由于IRMA中要分离的是游离抗体和抗原抗体复合物，都属于大分子，非特异的分离方法很难奏效。主要是靠单克隆抗体作为分离剂，因此在IRMA系统中需要两种抗体，至少需要两个抗原决定簇，对小分子的半抗原不合适。 * 非放射性标记免疫分析技术 酶标记免疫分析技术 化学发光免疫分析技术 荧光免疫分析技术 * 一、酶标记免疫分析技术 用酶分子代替放射性核素标记抗原或抗体，进行竞争性或非竞争性免疫分析的技术。其中应用最多的就是酶联免疫吸附分析法（ELISA）。 是结合了抗原抗体高特异性和酶促反应的高敏感性的检测技术。 * * ELISA方法是用酶分子标记抗体，进行与IRMA相似的夹心法免疫反应，反应结束后分离结合部分和游离部分，利用结合部分上的酶分子的催化活性将底物转化为特定颜色的产物，用分光光度计测定，颜色的深浅和酶量成正比，而酶量又和复合物的量成正比。 常用的酶是辣根过氧化物酶，底物是四甲基联苯胺 (TMB) ，反应后显黄色。 * 二、化学发光免疫分析技术 化学发光免疫分析技术是以化学发光物质代替放射性核素作为示踪物的超微量分析技术。 化学发光物质在氧化剂或催化剂的作用下能形成激发态产物，并在退激时将能量转化为光子的物质。 * 1. 化学发光免疫分析 是用化学发光物质作为标记物，标记抗原或抗体，反应以后，利用碱性条件下化学发光物质在氧化物作用下可以发生单光子放射。检测光子的数量就可以反映复合物的量。 常用的化学发光物质是异鲁米那和吖啶酯 * 2. 化学发光酶免疫分析 和ELISA相似，用碱性磷酸酶标记抗体，经夹心法免疫反应后，带有酶的复合物作用于特殊的底物(金刚烷)，使底物发射出光子。 此法光子发射持续时间较长，可靠性比较好。 * 3. 电化学发光免疫分析 4. 生物发光免疫分析 * 三、时间分辩荧光免疫分析技术 时间分辨荧光免疫分析技术是利用稀土元素（镧系元素）作为标记物。镧系元素在紫外线的激发下可以持续的发射出一定波长的荧光光子，而其他波长的光子寿命较短，待其他光子衰减后探测特定波长的特异性荧光光子就可以检测复合物的量。 * 时间分辨荧光免疫分析技术（time-resolved fluoroimmunoassay） （一）基本原理 时间分辨荧光免疫分析采用稀土元素标记抗体，利用时间分辨荧光仪特定的延迟时间测量，获得稀土元素的特异荧光信号，同时消除非特异性荧光物质的干扰。 * 标记物为具有独特荧光特性的稀土金属—镧系元素 镧系元素共有15种，应用在时间分辨荧光免疫技术种有四种：钐(Sm)，铕(Eu)，镝(Dy)，鋱(Te) 镧系元素荧光重要特点： 1. 极长的荧光衰退时间 铕：730000ns，钐：50000ns，一般荧光物质：10ns 2. 200nm的Stokes位移 铕：激发光340nm，发射光613nm 荧光素的Stokes位移为273nm 3. 狭窄的发射峰 4. 解离-增强技术可使其荧光性提高100万倍 * 时间分辨荧光免疫分析技术（time-resolved fluoroimmunoassay） 一、基本原理 镧系元素（15）：铕（Eu），钐（Sm），镝（Dy），鋱（Te） Eu + Eu Eu + 增强液 + Eu “解离增强镧系荧光免疫分析” * 时间分辨荧光检测的基本原理示意图 荧光衰退时间 铕：730000 ns 钐：50000 ns 一般荧光物质：10 ns 铕的荧光 * （二）TrFIA的特点 1. 最大限度提高测量方法的灵敏度 2. 有与RIA相似的特异性和精密度 3. 可同时测定两种以上的抗原 4. 无辐射污染 * DELFIA技术的特点为临床检测带来的先进性 技术 特点 检验先进性 时间分辨 将特异性荧光与