PCR引物设计(以p53基因为例).pptVIP

p53基因引物设计 临床八年1305班 冯昊 CONTENTS 目录 Part 1 引物设计原则 Part 2 获取目的基因 Part 3 引物设计 引物的设计原则 设计的目的是在两个目标间取得平衡：扩增特异性和扩增效率 PART ONE 1 2 引物长度 一般引物长度为18~30碱基。决定引物熔解温度（Tm值）最重要的因素就是引物的长度。长度越长，Tm值越大。 长度过长，退火温度和延长温度相差太小，不利于延伸反应。长度过短，特异性低 GC含量 一般为40%~60%，一对引物的GC含量和Tm值应该协调。若是引物存在严重的GC倾向或AT倾向则可以在引物5’端加适量的A、T或G、C尾巴 引 物 设 计 原 则 3 引物自身和引物之间 引物自身不应形成二级结构（如发夹结构） 引 物 设 计 原 则 引物之间不能形成二聚体（包括同种引物之间或上游引物与下游引物之间）且引物不能与DNA其他区域错配 引 物 设 计 原 则 4 引物末端 引物3′端：由于延伸从3′端开始，因而不能进行任何修饰；同时不应选择A，因为A-A、A-G错配。 3’端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发 引物5′端：主要限定引物长度，对扩增特异性影响不大；可以修饰，如添加限制性内切酶位点，将PCR产物亚克隆 引 物 设 计 原 则