盘古基因快速连接克隆体客户问答.docVIP

用户关于盘古基因快速连接克隆载体的常见问题 Customer Frequently Asked Questions (FAQ) 你们公司的快速连接载体是属于哪一种载体？ 答: 盘古基因的pACK系列快速连接克隆载体属于第三代拓扑克隆载体，由DNA拓扑异构酶介导的DNA连接。 你们的载体是平端的还是粘端的？ 答：盘古基因的pACK-Bs、pACK-Bm是平端载体（B = blunt, s = simple, m = multiple restriction endonuclease sites）, 我们的pACK-Ts, pACK-Tm是粘端、3’T-凸出载体。 你们的载体带不带酶切位点？ 答：pACK-Bm, pACK-Tm是克隆区两侧带有多个限制性内切酶位点的载体。 你们的载体能连大片段么？ 答：拓扑克隆载体比普通T载体容易连接大的插入片段。 你们的载体的测序引物怎么设计？ 答：通用引物测序，他们是M13F（-47）和M13R（-48），测序服务公司是免费提供的。 你们的载体的试剂盒的保存条件，保质期？ 答：-20℃保存，保质期一年。 什么是TOPO载体？ 答：TOPO的商标是Invitrogen的拓扑异构酶克隆载体，TOPO = Topoisomerase. 你们的载体是克隆载体还是表达载体？ 答：盘古基因的pACK载体系列属于普通克隆载体，用于克隆、测序、体外转录实验目的。 你们公司的载体阳性克隆率高，但菌落数有时多有时少，为什么？ 答：这个现象与客户的PCR产物浓度、反应时间长短有关，PCR产物不经纯化（如果条带特异性好，浓度30-50ng/uL, 可加2-3uL到1uL载体中，反应时间5-15分钟（22～37℃），不要大于15分钟，转化时，冰上静置时间不要大于30分钟，热激后摇菌的时间不要少于1小时（保证大肠杆菌有充分时间修复拓扑酶形成的缺口， 即Nicks）。 克隆载体如果在插入片段浓度高和低、片段大和小的时候都表现为同样多的菌落数，那就说明不正常，大多是生产厂商生产过程污染了其它质粒，这种事情在QA/QC控制不好的公司时常发生。阳性克隆率高的载体，在插入片段浓度过低的情况下，不可能有很多菌落产生。 10. 挑菌落的时候有一个挑出来，有一个没有挑出来，为什么？速度很快怎么才能达到准确 率高点？ 答：用镊子夹住无菌10uL枪头，看准了后用枪头轻轻一括（枪头侧面可粘住小的菌落），没挑好就不长。需要注意的是国内有很多公司的抗生素（氨苄，卡那）质量太差，可能分装自过期国产抗生素，这种情况下，挑取的菌落中常常有克隆不长，摇菌常常提不出质粒来。 11. 怎样选择合适的克隆载体？ 答：克隆大片段时用较大的载体（如pACK4a系列），克隆2kb以下的小片段时，用3kb以下的载体（如pACK2a, pACK2k）； 如果PCR引物自带酶切位点，可选用“S”系列（如pACK-Bs, pACK-Ts）； 如果PCR引物不带酶切位点，可选用“M”系列(如pACK-Bm, pACK-Tm)； 如果是高保真PCR酶的扩增产物，通常是平端，选用“B”系列产品（pACK-Bs, pACK-Bm）； 如果是Taq酶的PCR产物连接，请用拓扑载体“T”系列（如pACK-Ts, pACK-Tm）。 12. 插入片段的量多少合适？ 答：2kb以下的，30～50ng可行， 2kb以上的50～200ng为好，这个量是包含在不大于4uL的体积内（如要加200ng, 每uL至少50ng/uL浓度）。 13. 反应时间多长合适？ 答：5～15分钟，室温分子运动较慢，利于连接。 14. 连接产物可以保存多久？ 答：-20℃，不少于2年（和DNA质粒一样）。 15. 不长菌落是什么原因 答：大多数情况下，即便零背景拓扑克隆载体，直接用1uL载体转化感受态细胞，也还是有少量菌落的，因为细菌有修饰载体、重组质粒以获取抗药性功能，从而得以生存。一个菌落都不长的原因：1）感受态菌失活；2）拿错了抗生素琼脂板。 16. 阳性克隆率有时低，有时又高得出奇，怎么回事？ 答：拓扑异构酶载体具有切点外侧1-4个碱基的记忆能力，所以我们要求用户在设计PCR引物时，在引物的5’-末端加上1～2个“A”碱基做保护，这有助于拓扑载体的识别和高效连接（见载体使用说明书背面），也符合一般PCR引物的设计理念，加一个“A”对于引物的Tm值影响很小，若加一个“G”或“C”，Tm值有时会提高2～3℃，这个无关于模板的Tm大幅升温常常会增加PCR扩增的非特异性，这属于经典的PCR理论内容，PCR的成败，又直接关系到克隆过程。 17. 盘古基因的快速连接克隆载体属于哪一代克隆载体？ 盘古基因快速连接载