细胞病变抑制法方法学证.doc

细胞病变抑制法测定干扰素生物学活性 IFN-α2b 经PEG修饰后其活性位点仍然保留，因而我们沿用经典的细胞病变抑制法作为PEG-IFN-α2b的生物学活性检测方法，以《中华人民共和国药典》（2010年版）三部附录X C为检测依据。细胞病变抑制法作为一项成熟的生物学活性检测技术，已经广泛用于多类IFN亚型的生物学活性检测，并被收录入国家药典，目前国内上市IFN相关产品的活性检测多采用的该方法，多年的实践证明该方法检测结果稳定，可靠，重现性好。在此基础上，我们将该方法运用于PEG-IFN-α2b的生物学活性检测，并完成了专属性、线性、准确性、精密度和耐用性的方法学验证。具体操作如下： WISH细胞传代培养2～3天后经EDTA消化，用含10%新生牛血清的MEM培养液，配成3.0×105个细胞/ml，接种于96孔细胞培养板中，每孔100μl，于37℃，5%CO2条件下培养4～6小时；将4倍系列稀释的标准品溶液和供试品溶液移入接种WISH细胞的培养板中，每孔加入100μl，于37℃，5%CO2条件下培养18～24小时；弃去细胞培养板中的上清液，加入VSV继续培养，待达到病变要求染色，脱色，于570nm处测定吸光度，根据标准品和待测品稀释度的差异，计算出待测样品的生物活性。 专属性 干扰素生物学活性测定法，依据干扰素可以保护人羊膜细胞（WISH）免受水泡性口炎病毒（VSV）破坏的作用，用结晶紫对存活的WISH细胞染色，在波长570nm处测定其吸光度，得到干扰素对WISH细胞的保护效应曲线，以此测定干扰素生物学活性。满足专属性要求。 线性 干扰素对WISH细胞的保护效应与剂量相关，在干扰素活性为0.01IU/ml～250IU/ml范围内呈现典型的S型曲线，其相关系数（R）大于0.95以上，相关系数的平方（R2）大于0.90以上，满足线性要求。 sda） 准确性 以小试制备IFNα2b为样品1，以小试制备PEG-IFNα2b为样品2（生物学活性标示量为1000IU/ml）进行准确性验证。 结果如下：sda） 样品1 样品2 效价（IU/ml） 1075 1185 偏差（IU/ml） 75 185 准确度 7.5% 18.5% 生物制品的生物学活性为相对活性，与同时测定的标准品比较而得。由同时测定的IFNα2b及PEG-IFNα2b与标准品的剂量反应曲线可以看出，三条曲线具有平行性，即IFNα2b及PEG-IFNα2b与标准品的活性成分仅是量的不同而没有质的区别，可由此计算出相对活性结果。 精密度 由于生物活性（或效价）测定是生物制品质控中的重要指标，该方法的可靠性会直接影响产品的可控性，所以我们对生物活性测定方法的精密度验证非常重视。分别对IFN和PEG-IFN进行了精密度研究，检测结果下表，相对标准偏差分别为7.0%和14.7%，符合细胞实验精密度要求小于30%要求。 表 IFN效价指标的精密度验证 IFN 第一次 第二次 第三次 效价（×108IU） 1.12 1.21 1.29 平均值（×108IU） 1.21 标准偏差（×108IU） 0.08 相对标准偏差 7.0% 表 PEG-IFN效价指标的精密度验证 PEG-IFN 第一次 第二次 第三次 效价（×107IU/ml） 2.12 2.59 1.96 平均值（×107IU） 2.22 标准偏差（×107IU） 0.33 相对标准偏差 14.7% sda S1：IFN（0.51mg/ml） S2：PEG-IFN（1.43mg/ml） S3：其他样品 S4：PEG-IFN（1.43mg/ml） sda S1：IFN（0.51mg/ml） S2：PEG-IFN（1.43mg/ml） S3：IFN（0.51mg/ml） 耐用性 生物学测定结果对分析条件往往比较敏感，为了确保在每一次实际测定中方法的有效性，我们进行了耐用性研究，根据耐用性研究的结果建立一系列系统适用性参数，如细胞状态、温度、二氧化碳等。研究结果表明，细胞状态对结果影响很大，检测时需选择对数生长期的，状态良好的细胞。在37.0±0.5℃范围内对细胞培养无显著性影响，实际测定时培养温度都控制在37.0±0.2℃范围内。WISH细胞对二氧化碳较敏感，需要保证一定浓度的二氧化碳，实际测定时二氧化碳浓度都控制在4.5%～5.0%范围内。