生实验课件2011年12月15日修改解剖.docVIP

植物总蛋白提取及检测方法 实验一 植物蛋白提取——三氯醋酸-丙酮沉淀法 　 取1-2克材料于液氮充分研磨，加入10mL预冷的含10%三氯乙酸（TCA）、0.07%β-巯基乙醇（可用DTT代替）的丙酮，充分混合后-20℃下冰浴过夜，然后离心（4℃，40000×g，1h），弃上清。在沉淀中加入10mL预冷的含0.07%DTT的丙酮，充分混合，-20℃下放置1h，离心（4℃，40000×g，1h），重复该步骤2-3遍。沉淀冷冻干燥蛋白然后分装放入-80℃备用。 取取纯化后的晶体蛋白4.0mg，加入400μl裂解液（1mg蛋白：100μl裂解液）振荡器上振荡溶解，然后13200rpm离心15min除杂质，取上清分装，每管70μl，-80℃保存。 按20μL/mg的比例加入蛋白裂解液（9mol/L尿素，4%CHAPS，1%IPG缓冲液，1%DTT，35 mmol/ L Tris），30℃水浴1 h，并不时振荡，12 000×g 下离心10min。上清液中加入4倍体积的预冷丙酮，于- 20℃下放置至少2 h，4 000 ×g 下离心10min，沉淀用水化缓冲液（8 mol/L尿素，2% CHAPS，20mmol/ L DTT，0. 5%IPG缓冲液）溶解，重复该步骤1~ 2 遍。样品溶液存于-75 ℃下或直接用于电泳。 用Bradford法在波长595nm定量蛋白。 试剂： 1、提取液：含1