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第二节 固液分离工程及设备 第三节 细胞破碎方法 3.2 细胞破碎理论 1)、细胞破碎 A 压撞 B 剪切 Ca 渗透 Cb 冻胀 D 破壁破膜 3.3 细胞破碎方法 反复冻融法 于将细胞在-20度以下冰冻,室温融解,反复几次,由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀,使细胞结构破碎。 冷热变替法 将材料投入沸水中,于90℃左右维持数分钟,立即置于冰浴中使之迅速冷却,绝大部分细胞被破坏。 渗透压冲击法 细胞在高渗透压介质中平衡后,再突然将其转至低渗透压环境中,水会大量进入细胞,使细胞壁和膜胀破。 (3)化学破碎又称化学渗透:其原理是利用化学或生化试剂(酶)改变细胞壁或细胞膜结构,增大胞内物质的溶出速率;或者完全溶解细胞壁,形成原生质体后,在渗透压作用下使细胞膜破裂而释放胞内物质。 优点: A、产品释放的选择性; B、提取速度和收效高; C、产品的破坏小; D、对外界环境,如pH和温度等要求低; E、不残留细胞碎片。 粉碎后的新鲜材料在0℃以下加入5~10 倍量的丙酮,迅速搅拌均匀,可破碎细胞膜,破坏蛋白质与脂质的结合。蛋白质一般不变性,被脱脂和脱水成为干燥粉末。用少量乙醚洗,经滤纸干燥,如脱氢酶等可保存数月不失去活性。 将待破碎的鲜材料在一定pH和适当的温度下,利用自身的蛋白酶将细胞破坏,使细胞内含物释放出来。 自体融解时需要时间,需加少量甲苯、氯仿等。应防止细菌污染。 自体融解过程中pH 显著变化,随时要调节pH。 自溶温度选在0~4℃,因自溶时间较长,不易控制,所以制备活性蛋白质时较少用。 能溶解菌的酶分布很广。尤其卵白中含量高,而多易结晶化。1g 菌体加1~10mg 溶菌酶, pH6.2~7.0 1h 内完全溶菌。 除溶菌酶外,蜗牛酶及纤维素酶也常被选为破坏细菌及植物细胞用。 3.4 物理法和化学法的比较 物理破碎法缺点: A、高能、高温、高噪音、高剪切力(四高),易使产品变性失活; B、非专一性,胞内产物均释放,分离纯化困难; C、细胞碎片大小不一,难分离。 化学破碎法缺点: A、费用高; B、引起新的污染,尤其是其他化学方法; C、一般只有有限的破碎,常需与其他物理法连用。 3.5 破碎方法的选择 选择的一般原则 A、提取产物在细胞质内,用机械法破碎 B、提取产物在细胞膜附近,用化学法 C、提取产物与细胞膜和细胞壁结合,可采用化学法和机械法结合的方法 破碎技术杂交研究应注意的问题 A、杂交技术可产生很大优势。 B、破碎技术对下游分离技术的影响。破碎颗粒清除,产物的分离纯化 C、在发酵阶段,考虑到发酵过程和环境对破碎难易程度的影响 D、菌种的培育,胞内产物 ? 胞外产物 3.6 细胞器的分离 细胞器包括细胞核、线粒体、核糖体、内质网,植物细胞还有叶绿体。 如果要分离制备分布在这些细胞器中的生物大分子,为了防止其他细胞组分中的物质对制备物的干扰或污染,还需先将细胞器分离出来,然后在某一细胞器中分离某一物质。 细胞器的分离一般采用差速离心法,即将破碎后的细胞在适当的介质中进行离心,常用的介质有蔗糖、甘露醇、柠檬酸、聚乙二醇等。 作 业 1. 名词解释 凝聚;絮凝;破碎率;离心分离因数。 2. 简述发酵液预处理的目的和处理方法。 3. 细胞破碎的方法有哪些? 单元组成 板 布 板 布 板 操作注意点 尽量使工作时间和辅助时间接近; 降低滤液粘度 (2) 真空转鼓过滤机 1)切向流过滤,又称错流过滤 交叉过滤和十字流过滤,是一种维持恒压下高速过滤的技术。其操作特点是使悬浮液在过滤介质表面作切向流动,利用流动的剪切作用将过滤介质表面的固体(滤饼)移走。 2)双水相萃取 向水相中加入溶于水的某些高分子化合物(如葡聚糖、聚乙二醇等)后,形成密度不同的两相,轻相中富含某种高分子化合物,重相中富含盐类或另一种高分子化合物,从而达到分离和提纯某种高分子化合物的目的。 3)吸附法 向细胞碎片悬浮液中加入某种固体吸附剂,或者用细胞碎片悬浮液通过装有吸附剂的固定床,即可达到除去细胞碎片的目的。主要的问题是很难选择合适的吸附剂,以保证目的产物不被吸附而损失。 3. 其他固液分离方法 破碎率:被破碎细胞的数量占原始细胞数量的百分数。 N0:原细胞数,N:破碎后残存的正常细胞。N0和N的可通过直接计数和间接计数法得到。 超声波法 高压匀浆机 组织捣碎机 细菌磨 珠磨法 反复冻融法 渗透压冲击法 冷热变替法 有机溶媒法 自溶法 酶法 机械破碎法 物理破碎法 化学破碎法 细胞破碎法 超声波破碎 超声波破碎原理:超声波作用下液体发生空穴化作用,产生极大的冲击波和剪切力
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