第二章 固液分离和细胞破碎.ppt

第二节 固液分离工程及设备 第三节 细胞破碎方法 3.2 细胞破碎理论 1)、细胞破碎 A 压撞 B 剪切 Ca 渗透 Cb 冻胀 D 破壁破膜 3.3 细胞破碎方法 反复冻融法 于将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。 冷热变替法 将材料投入沸水中，于90℃左右维持数分钟，立即置于冰浴中使之迅速冷却，绝大部分细胞被破坏。 渗透压冲击法 细胞在高渗透压介质中平衡后，再突然将其转至低渗透压环境中，水会大量进入细胞，使细胞壁和膜胀破。 （3）化学破碎又称化学渗透：其原理是利用化学或生化试剂（酶）改变细胞壁或细胞膜结构，增大胞内物质的溶出速率；或者完全溶解细胞壁，形成原生质体后，在渗透压作用下使细胞膜破裂而释放胞内物质。 优点： A、产品释放的选择性； B、提取速度和收效高； C、产品的破坏小； D、对外界环境，如pH和温度等要求低； E、不残留细胞碎片。 粉碎后的新鲜材料在0℃以下加入5～10 倍量的丙酮，迅速搅拌均匀，可破碎细胞膜，破坏蛋白质与脂质的结合。蛋白质一般不变性，被脱脂和脱水成为干燥粉末。用少量乙醚洗，经滤纸干燥，如脱氢酶等可保存数月不失去活性。 将待破碎的鲜材料在一定pH和适当的温度下，利用自身的蛋白酶将细胞破坏，使细胞内含物释放出来。 自体融解时需要时间，需加少量甲苯、氯仿等。应防止细菌污染。 自体融解过程中pH 显著变化，随时要调节pH。 自溶温度选在0～4℃，因自溶时间较长，不易控制，所以制备活性蛋白质时较少用。 能溶解菌的酶分布很广。尤其卵白中含量高，而多易结晶化。1g 菌体加1～10mg 溶菌酶， pH6.2～7.0 1h 内完全溶菌。 除溶菌酶外，蜗牛酶及纤维素酶也常被选为破坏细菌及植物细胞用。 3.4 物理法和化学法的比较 物理破碎法缺点： A、高能、高温、高噪音、高剪切力(四高)，易使产品变性失活； B、非专一性，胞内产物均释放，分离纯化困难； C、细胞碎片大小不一，难分离。 化学破碎法缺点： A、费用高； B、引起新的污染，尤其是其他化学方法； C、一般只有有限的破碎，常需与其他物理法连用。 3.5 破碎方法的选择 选择的一般原则 A、提取产物在细胞质内，用机械法破碎 B、提取产物在细胞膜附近，用化学法 C、提取产物与细胞膜和细胞壁结合，可采用化学法和机械法结合的方法 破碎技术杂交研究应注意的问题 A、杂交技术可产生很大优势。 B、破碎技术对下游分离技术的影响。破碎颗粒清除，产物的分离纯化 C、在发酵阶段，考虑到发酵过程和环境对破碎难易程度的影响 D、菌种的培育，胞内产物 ? 胞外产物 3.6 细胞器的分离 细胞器包括细胞核、线粒体、核糖体、内质网，植物细胞还有叶绿体。 如果要分离制备分布在这些细胞器中的生物大分子，为了防止其他细胞组分中的物质对制备物的干扰或污染，还需先将细胞器分离出来，然后在某一细胞器中分离某一物质。 细胞器的分离一般采用差速离心法，即将破碎后的细胞在适当的介质中进行离心，常用的介质有蔗糖、甘露醇、柠檬酸、聚乙二醇等。 作 业 1. 名词解释 凝聚；絮凝；破碎率；离心分离因数。 2. 简述发酵液预处理的目的和处理方法。 3. 细胞破碎的方法有哪些？ 单元组成 板 布 板 布 板 操作注意点 尽量使工作时间和辅助时间接近； 降低滤液粘度 (2) 真空转鼓过滤机 1）切向流过滤,又称错流过滤 交叉过滤和十字流过滤，是一种维持恒压下高速过滤的技术。其操作特点是使悬浮液在过滤介质表面作切向流动，利用流动的剪切作用将过滤介质表面的固体（滤饼）移走。 2）双水相萃取 向水相中加入溶于水的某些高分子化合物（如葡聚糖、聚乙二醇等）后，形成密度不同的两相，轻相中富含某种高分子化合物，重相中富含盐类或另一种高分子化合物，从而达到分离和提纯某种高分子化合物的目的。 3）吸附法 向细胞碎片悬浮液中加入某种固体吸附剂，或者用细胞碎片悬浮液通过装有吸附剂的固定床，即可达到除去细胞碎片的目的。主要的问题是很难选择合适的吸附剂，以保证目的产物不被吸附而损失。 3. 其他固液分离方法 破碎率：被破碎细胞的数量占原始细胞数量的百分数。 N0：原细胞数，N：破碎后残存的正常细胞。N0和N的可通过直接计数和间接计数法得到。 超声波法 高压匀浆机 组织捣碎机 细菌磨 珠磨法 反复冻融法 渗透压冲击法 冷热变替法 有机溶媒法 自溶法 酶法 机械破碎法 物理破碎法 化学破碎法 细胞破碎法 超声波破碎 超声波破碎原理：超声波作用下液体发生空穴化作用，产生极大的冲击波和剪切力