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Assembly of single chromatin fibers depends on the tension in the DNA molecule: Magnetic tweezers study 基于磁阱的研究，单个染色质纤维的组装取决于DNA分子上的张力 Sanford H. Leuba*, Mikhail A. Karymov, Miroslav Tomschik*, Ravi Ramjit, Paul Smith**, and Jordanka Zlatanova PNAS January 21, 2003 vol. 100 no. 2 495-500 一、研究背景 1、已知信息： 1）真核细胞中染色质的形态：102bp-168bp 的DNA包裹组蛋白形成左手超螺旋的基本单位核小体，核小体在DNA上以一定的距离间隔分布。这种串珠型的结构进一步压缩直至适应细胞核的尺寸大小。 2）染色质重塑：在DNA复制和RNA转录过程中，压缩紧密的染色质纤维需要解凝集，移除组蛋白，暴露DNA上的复制或转录原件。待复制或转录结束，染色质纤维和组蛋白结合，再次恢复压缩紧密的结构。 3）DNA或RNA聚合酶结合在DNA模板链上，会形成30-40pN大小的作用力。 2、提出问题： DNA链需要受到多大的力才能发生染色质纤维和组蛋白的组装？ 二、实验材料 λ-DNA、生物素化的dUTP 和 dCTP，NAP-1（形成核小体时的辅助蛋白）以及磁阱平台搭建材料。 三、实验设计 1、平台搭建及参数的获取（图1） 平台搭建如图1所示。实验中需要获得的参数：磁珠在每一帧画面的坐标（x和y）、DNA链与y轴方向上的夹角ψ以及磁珠在屏幕中摆动距离（distance travelled across screen）。 图 1 2、组装实验（图2） 1）continuous-flow：持续往容器中通入含有组蛋白和NAP-1的液流； 2）stopped-flow：在染色质纤维初始组装后，停止往其中通入含有组蛋白和NAP-1的液流； 3）染色质纤维解离：使用2M的NaCl通入容器中进行盐诱导解离（salt-induced disassembly）。 3、实验中须明确的事项 1）stopped-flow实验中，若磁铁与容器的距离不变，磁珠所受的力为恒力，不考虑磁珠因在组装或解离过程中DNA长度变化所造成受力的变化； 2）降低实验环境的复杂程度，本实验只是研究在不含有任何超螺旋的λ-DNA（naked DNA，208bp的序列重复12次，可形成12个核小体结构）上核小体初始组装过程，并不关注最终核小体成熟的结构，因此，整个过程中只涉及到一种辅助组装蛋白NAP-1。 图2 四、结果与分析 1、辅助组装蛋白NAP-1参与重组后核小体的特征 图3 图3 A 左边四个泳道，是核小体组装过程中，证明NAP-1对naked DNA影响的核酸电泳实验。可以看出含有NAP-1核蛋白组装复合体的迁移速率大于不含NAP-1的，说明NAP-1起到帮助染色质纤维与组蛋白的相互缠绕。图A右边第2、3泳道是一种化学外切酶（MPE）对组装后的染色质纤维进行酶切的电泳实验，可以看出酶切后形成12个条带，说明较之未被组装的染色质，组蛋白可以防止DNA被MPE切成更小的片段。 图3 B是利用AFM对组装后的染色质纤维的成像。图3 C是λ-DNA作为重组底物的成像。两者非常相像。 2、组装实验 图4 组装实验主要分为两种：continuous-flow和stopped-flow。图4 A-C属于continuous-flow实验，图4 D-E属于stopped-flow实验。 图A和图D呈现的是磁珠在组装的过程中的位置信息（x和y）。A和D实验中设置相同的对照组：a 仅有磁极时，磁珠的位置信息；b 仅通入组装液流时，磁珠的位置信息。无论是continuous-flow还是stopped-flow实验，两幅图中都可以反映出随着组装反应的进行，磁珠的位置渐渐朝向坐标原点（向左和向下方运动）。其主要区别在于D中，停止通入液流后，磁珠仅受到磁极的力，此时沿着x轴方向朝原点水平移动，待稳定后，再沿着y轴方向朝着原点方向竖直下降；而A中，在通入也流过程中，磁珠受到磁极和液流的两个力作用，同时沿着x和y轴朝着原点远动，在图中呈现为一条斜线趋势。 图B和图E呈现的是磁珠在组装的过程中的屏幕中摆动的距离。随着组装反应的进行直至完成，磁珠远动的摆动的距离越来越小。在图E中，可以明显看到磁珠最终稳定在一个数值。 图C呈现的是完成组装的核小体盐诱导下解离的过程。随着解离反应的进行，磁珠摆动的距离也越来越大，直至最