实验三外源基因在大肠杆菌中的诱导表达与检测讲义.ppt

实验四 外源基因在大肠杆菌中的诱导表达与检测 讲师：王聪艳 一、实验目的： 1、了解外源基因表达常用的载体及其特点。 2、通过本实验掌握原核基因表达产物分离的方法。 3、通过本实验掌握原核基因表达检测的方法。 二、实验原理： 1、大肠杆菌是分子生物学研究中表达外源基因的最常用的模式细胞之一，外源基因与通过特殊原核表达载体转化大肠杆菌细胞。常见载体有冷休克表达载体pCold?系列载体和pET表达载体系统。 pCold?系列载体是利用大肠杆菌冷休克基因CspA启动子序列和5’非编码区的蛋白质表达系统。在CspA启动子下游插入了lac operator，可以严格调控目的基因的表达。可采用低温诱导载体及携带表达的方法，使大肠杆菌自身的蛋白质合成受到抑制、目的蛋白质获得高效表达。和以前的大肠杆菌表达系统-pET系统相比，在蛋白质表达量和可溶性上有所提高。  pET系统是在大肠杆菌中克隆和表达重组蛋白的系统。目标基因被克隆到T7噬菌体强转录和翻译信号控制之下，并通过宿主细胞提供的T7 RNA聚合酶来诱导目标基因表达。 二、实验仪器、用具、药品 聚丙烯酰胺凝胶电泳装置、电磁炉、水浴锅、 微量移液器、注射器、 Ecoli （pET-32a空载体）、 Ecoli （ pET-32a 携带外源基因）、 Ecoli （无载体）IPTG 、标准分子量蛋白等。