我国部分省区鸡传染性法氏囊病病毒的分子流行病学研究.docVIP

我国部分省区鸡传染性法氏囊病病毒的分子流行病学研究 鸡传染性法氏囊病（Infectiousbursaldisease,IBD）是由鸡传染性法氏囊病病毒（Infectiousbursaldiseasevirus,IBDV）引起的一种主要危害幼鸡的急性、高度接触性、杀淋巴细胞性的传染病[1]。临床上存在着超强毒株（veryvirulentIBDV,vvIBDV）、经典毒株（classicalIBDV，cIBDV）和变异株（variantIBDV,vIBDV）等各种致病型病毒的流行，使病情变得复杂。同时，它是一种免疫抑制性疾病。长期、严重的免疫抑制使鸡群对其它病毒性或细菌性继发感染的敏感性增加，对各种疫苗应答下降，甚至引起免疫失败[2-4]。有资料表明，对肉鸡和产蛋鸡而言，1周龄内感染vvIBDV易导致免疫抑制、生产性能差，且可以对马立克氏病（MD）和呼吸系统疾病（如ND、AI和IB）的弱毒疫苗初次免疫时的抗体应答水平较差[5]。目前认为该病毒VP2基因高变区（highlyvariableregion,HVR）氨基酸残基的突变是引起病毒毒力及抗原变异的一个重要因素，研究表明IBDV毒力及抗原的变异50%发生在该区域。因此，分离与鉴定IBDV地方流行毒株，从分子水平对分离毒株进行研究，分析其核苷酸序列及推导的氨基酸序列，可帮助我们更好地了解和追踪病毒的基因变异情况，有助于临床上正确地使用疫苗、研制新型的疫苗和建立有效的防治措施。yz.ag365yz.ag365①1材料与方法yz.ag365yz.ag365①1.1病料:收集于广西（包括南宁、北海、玉林三个主要养鸡地区）、江苏、浙江、安徽各地的临床疑似IBD的病鸡及其有肿大、出血以及炎症渗出物等病变的法氏囊组织以及骨髓和脾脏。yz.ag365yz.ag365①1.2鸡胚:9天龄健康鸡胚，分别购自南宁市良凤农牧有限责任和广西华桂源种禽有限。yz.ag365yz.ag365①1.3试剂:M-MLV逆转录酶（2.5U/micro;L）、TaqDNA聚合酶（2.5U/micro;L）、dNTPs(25mmol/L)、MgCl2(25mmol/mL)、10×PCRBuffer以及组织样品RNA抽提的UNIQ—10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒,均购自上海生工生物工程有限；限制性内切酶SspⅠ（10U/micro;L）和SacⅠ（10U/micro;L），购自东洋坊；AgaroseGelDNAPurificationKit，购自TakaRa；其它所用试剂购自其它商业试剂并均为分析纯产品。yz.ag365yz.ag365①1.4IBDV商品疫苗毒株：分别从疫苗市场购得，见表1。yz.ag365yz.ag365①yz.ag365yz.ag365①yz.ag365yz.ag365①1.5病料核酸的检测：yz.ag365yz.ag365①1.5.1病料处理采集到的法氏囊组织、骨髓和脾脏，经剪碎，按1:5比例加入灭菌生理盐水制成悬液，反复冻融三次，3000转/min离心5min，取上清保存备用。yz.ag365yz.ag365①1.5.2RNA的抽提病料组织悬液的上清使用UNIQ—10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒并按其产品说明进行RNA的抽提，最后加入无RNA酶的双蒸水25micro;L溶解抽提的RNA，立即进行反转录或-20℃保存。yz.ag365yz.ag365①1.5.3反转录合成cDNA取抽提的RNA样品14.5micro;L，加入随机引物1micro;L（25pmol/micro;L），70℃作用5min.，置-20℃冰浴作用5min.，然后加入5×RTBuffer5micro;L、dNTPs2micro;L、Rnasin0.5micro;L、M-MLV逆转录酶1micro;L，混匀，置42℃反转录1h，96℃灭活反转录酶5min，即得cDNA。获得的cDNA可直接用于PCR扩增或置-20℃保存待用。yz.ag365yz.ag365①1.5.4vVP2片段的PCR扩增扩增的引物及其反应参数参照韦平等[6]和龙进学等[7]的方法进行。具体操作步骤如下：在反应管中加入3micro;L经反转录获得的cDNA、10×PCRBuffer2.5micro;L、MgCl21.5micro;L、引物0.5micro;L(50pmol/micro;L)、dNTPs0.5micro;L、TagDNA聚合酶0.6micro;L，加灭菌双蒸水至25micro;L，按如下程序进行PCR扩增：95℃，3min；94℃，30s；58℃，30s；68℃，1min；94℃→58℃→68℃三个步骤共循环35次；最后68℃延伸7min后终止反应。预期扩增的目的片段大小约为471bp。yz.ag365yz.ag365①1.5.