组织DNA的提取与纯化详解.ppt

组织DNA的提取与纯化 检验系生化教研室 陈宁 讲课内容 一、概述 DNA在生物组织中以核蛋白的形式存在于细胞核中。 单倍体人类DNA平均相对分子量为6×1010 道尔顿，相当于1.3×105kb。 二、实验原则 保证DNA一级结构的完整性 排出其他干扰性分子的污染 三、实验操作及相关试剂介绍 【实验方法】 物理方式：玻璃珠法 超声波法 研磨法 冻融法 化学方式：异硫氰酸胍法 酚-氯仿抽提法 碱裂解法 生物方式：酶法 思考题 整个实验过程中，一共有几次离心？每次离心的作用是什么？各个分层中的内容是什么？ * 概述 1 试验原则 2 实验操作及相关试剂介绍 3 注意事项 4 DNA的分类有： 真核DNA 细菌DNA 病毒DNA 质粒DNA DNA样品的来源： 组织 – 肝脏、赘生物、肌肉、培养细胞 血液 细菌 – 培养细菌、质粒 干扰分子 对酶有抑制作用的物质 样品中存在的其他生物大分子 有机溶剂、高浓度的金属离子等 蛋白质、多糖和脂类 应尽量将此类物质的浓度降低到最小程度 相应抽提对象之外的核酸污染 DNA抽提时，应避免RNA干扰 相关因素对于核酸的影响： 机械剪切力、高温剧热环境 过酸、过碱的反应体系 各种核酸酶降解效应 物理因素 化学因素 生物因素 操作轻柔，切忌剧烈混匀、震荡；控制实验温度 pH 4~10 EDTA缓冲液 避免干扰因素的解决方法 简化操作步骤，缩短提取过程，减少各类因素对核酸的降解。 酚-氯仿抽提法 提取组织 组织匀浆 水相 (DNA,RNA) 絮状沉淀 (DNA,少量蛋白质,RNA) DNA 裂解液 苯酚-氯仿 离心 离心 离心 氯仿-异戊醇 5mol/L NaCl 冰无水乙醇 75%乙醇 TE 1. 裂解液 0.1mol/L NaCl 1% SDS （十二烷基磺酸钠） 10mmol/L Tris-HCl pH8.0 1mmol/L EDTA pH8.0 阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。 抑制DNA酶活性 pH值适宜DNA游离至水相，避免降解。 2. 苯酚-氯仿 （3:1，V:V） Tris-HCl 饱和 操作时，应将移液管伸至试剂瓶底部，吸取下层试剂。 苯酚与氯仿均为表面变性剂，能够有效地去除水溶液中的蛋白质，使其变性后沉淀。 3. 氯仿-异戊醇（24:1，V:V） 经酚氯仿试剂第一次抽提后的水相中有残留的酚，由于酚与氯仿是互溶的，可用氯仿第二次变性残余的蛋白质，同时一起将酚带走。 加入异戊醇能降低分子表面张力，所以能减少抽提过程中的泡沫产生。同时异戊醇有助于分相，使离心后的上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相维持稳定。 4. 5mol/L NaCl 使水溶液中的DNA易于聚合，从而形成钠盐沉淀。 反应体系为pH 8.0时，DNA分子所带的电荷为负电荷。加入NaCl溶液后，Na+能够中和DNA外周的负电荷，减少DNA分子之间因同种电荷产生的排斥力，使得DNA分子相互靠拢。 5. 冰无水乙醇 冰： 低温条件能降低分子运动，避免DNA破坏，而易于沉淀出DNA。 ① DNA不溶于乙醇 。 ② 乙醇可以吸附水分子（极性相同），使得溶液中相对的水分子减少，增大了DNA在水中的相对浓度。 ③ 乙醇沉淀DNA需要盐离子，用金属离子屏蔽DNA上磷酸的负电荷，降低DNA分子间的斥力，才能沉淀完全。 所以，之前须加入5M NaCl。 6. 75%乙醇 洗涤作用，去除残余的金属离子。同时，保护DNA完整性，避免降解；抑制核酸酶活性。 7. TE缓冲液 TE缓冲液是Tris + EDTA缓冲液，一般用作溶解剂或保持剂，主要是调控pH。 TE缓冲液是弱碱性,对DNA的碱基有保护性。 DNA在TE提供的环境中稳定性较好,不易破坏其完整性或产生开环及断裂。包括提取好的DNA也要放在TE缓冲液中保存。 【操作】 抽提组织加入裂解缓冲液制成匀浆 加入等体积的苯酚-氯仿试剂，缓慢颠倒5min后，2500rpm离心10min 吸取上清液至干净离心管 加入等体积氯仿-异戊醇，摇匀5min，2500rpm离心10min 记录上清液体积，吸取上清液至玻璃管，加入5mol/LNaCl,并稀释至0.3mol/L,再加入2.5倍体积冰无水乙醇，缓慢摇匀，出