脂肪干细胞脂诱导及鉴定程序.docVIP

脂肪干细胞成脂诱导及鉴定程序 试剂准备 成脂分化诱导液（Adipogenic Medium, AM）配方【1】： 试剂名称 浓度 商品信息 极限必须培养基 (Dulbecco’S Modified Eagle Medium ，DMEM) 1.0 L (SH30021.01B, Hyclone) 胎牛血清 （Fetal Bovine Serum，FBS） 10% (ES-009-B, Millipore) 青霉素/链霉素 （Penicillin/Streptomycin） 1% （TMS-AB2C, CHEMICON） 地塞米松 (Dexamethasone,DM) 1μmo／L 分子量： 392.46 (D4902-25MG, Sigma) 胰岛素 (Insulin, IS) 10 μmol／L 分子量： 5808 (91077C—1g, Sigma) 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 (Isobutylmethylxanthine,IBMX) 0.5 mmol／L 分子量：222.24 ( I5879-100MG, Sigma) 吲哚美辛 (Indomethacin,ID) 200 μmol／L 分子量：357.79 (I7378—5G, Sigma) 成脂分化诱导液浓储液配制 试剂名称 质量 浓缩倍数 配制方法 Stock A 胎牛血清 1ml/管 1X( liquid） 分装1ml/管X100 保存：-20℃ Stock B 青霉素/链霉素 0.1ml/管 100X( liquid） 分装0.1ml/管X100 保存：-20℃ Stock C 地塞米松 0.0117738 g 1000X 溶于30ml 无水乙醇(0.1%) 分装0.1ml/管X300 保存：-20℃ Stock D 胰岛素 0.05808 g 100X 溶于10ml Hcl(0.1 mol/L，PH2.0) 分装0.1ml/管X100 保存：4℃ Stock E 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 0.05556 g 200X 溶于2.5ml DMSO(0. 5%) 分装0.05ml/EP管X50 保存：-20℃ Stock F 吲哚美辛 0.07155 g 500X 溶于2ml 无水乙醇(0.2%) 分装0.02ml/管X100 保存：-20℃ 成脂分化诱导液工作液配制（10ml） 取DMEM(L)8.72ml加入15ml离心管（BD）; 加1管Stock A（1ml）； 加1管Stock B（0.1ml）； 取1管Stock C（0.1ml）溶解，加入0.01ml； 加1管Stock E（0.05ml）； 加1管Stock F（0.02ml）； 加1管Stock D（0.1ml）； 测渗透压，调pH7.2-7.4; 0.22μm微孔过滤，4℃贮存，一周内使用。 Stromal Medium配制（10ml）【２】： 取DMEM8.9ml加入15ml离心管（BD）; 加入1管Stock A（1ml）； 加入1管Stock B（0.1ml）； 调pH7.2-7.4; 0.22μm微孔过滤，4℃贮存，一周内使用。 0.5%油红“O”配制【３】 油红“O”0.5 g溶于100ml 无水乙醇（50%），分装备用，使用前0.22μm过滤 4%多聚甲醛液配制 试剂名称 质量/体积 甲醛 4g PBS 100ml 调PH7.2-7.4，0.22μm微孔过滤后使用。 方法 细胞诱导培养【4】 间充质干细胞传代培养至第三代，待细胞融合至80%左右，从培养箱内取出细胞至垂直超净台； X、Y轴方向摇动培养皿，3次/方向； 1ml微量移液器吸弃培养液； 加入预温PBS，1ml/孔； X、Y轴方向摇动培养皿，3次/方向； 吸弃PBS； 重复步骤（4）—（6），漂洗细胞，2次； 加入Trypsin/EDTA消化液，1ml/孔，5min，37℃； 加入等量Stromal Medium，终止消化； 1ml微量移液器彻底吹洗皿底，收集细胞悬液至15ml离心管内； 1400rpm,RT,5min; 小心取出离心管，吸弃上清； 加入Stromal Medium重悬消化下来的细胞； 按1× 104个/ml接种到24孔板内（此时若解冻细胞，按冻存密度5*105个/ml计算，可铺6孔板10个孔，12孔板25个孔，24孔板50个孔），加入Stromal Medium培养基培养3天，设置对照组（一直使用Stromal Medium培养），空白组（添加DMEM覆盖皿底即可）； 3天后，实验组吸弃原有培养基，换用成脂诱导培养基（AM）； 每2-3天换液一次； 诱导2周后，初始脂肪形成时用油红“O”染色进