编号农业微生物研究中心,共6页.docVIP

2011-10-17 承担单位：福建省农科院农业生物资源研究所 试验设计： 试验项目：BSA与阿维菌素藕合机理的探讨 试验人员：潘志针、齐帆、朱育菁 试验负责：朱育菁 报告日期：2011-10-17 计数月份：2011年10月 研究资格系数 (0.5-1.0) 实验设计系数 （0.9-1.0） 报告得分 总分 实验设计 实验记载 实验分析 实验简报 实验文章 1-20% 21-40% 41-60% 61-80% 81-100% 1%-5% 设计，实施实验，记载，分析清晰，结论清晰文献完整，发表水平 福建省农业科学院农业生物资源研究所 农业微生物研究中心 电话: 0591 传真: 0591 1．试验目的 2．试验 2.1.1试剂 Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液，4-O-AVM（4-O-琥珀酰阿维菌素）（自己合成的）， N,N-二甲基甲酰胺，EDC.HCl，NHS ，SDS相关试剂 2.1.2 实验器具及仪器2.2 4-O-AVM的活化 EDC.HCl是良好藕合零键桥联剂，能活化羧基，提高酯化时羧基的活性。本试验采用N-羟基琥珀酰亚胺酯法实现BSA与4-O-AVM的藕合。称取10 mmol/L的4-O-AVM和20 mmol/L的NHS和EDC.HCl室温下搅拌过夜。 2.3 BSA与4-O-AVM藕合的荧光滴定 配制5 μmol/L的BSA母液（溶剂为Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液），1 mmol/L和2.5 mmol/L的4-O-AVM的母液。固定荧光分光光度计的光路（控制比色皿放入的位置和深度都一样），加入1ml的BSA母液，按BSA蛋白摩尔浓度0.2，0.4，0.6，0.8，1，1.5，2，2.5，3的倍数，逐次加入4-O-AVM，每次1μl 。等小分子与BSA完全结合，即荧光值稳定后测定并记录荧光值（一般为2 min后），根据荧光数据分析小分子与BSA的结合比及本征结合常数。在25℃，激发波长为285 nm，激发狭缝和发射狭缝宽均为5 nm，扫描范围300~450 nm，扫描速度600 nm/min条件下，逐次测定4-O-AVM滴定BSA的内源荧光发射谱。每个1 nm收集一次数据，荧光发射光谱均扫描3次取平均值。 2.4 SDS检测BSA和4-O-AVM的藕合结果 10%分离胶的配置： PH8.9 Tris.HCl 的分离胶缓冲液 2.50 ml 30% Acr-Bis 6.66 ml 10%AP 0.10ml TEMED 0.10 ml H2O 10.44 ml 10% SDS 0.20 ml 浓缩胶的配置： PH6.7 Tris.HCl 的分离胶缓冲液 1.25 ml 30% Acr-Bis 1.00 ml 10%AP 0.05ml TEMED 0.05 ml H2O 7.55 ml 10% SDS 0.10 ml 取适量的样品于上样缓冲液中，100摄氏度加热10min变性后，聚丙烯凝胶电泳分析。样品的上样量为20 μl， 恒压120V电泳一个小时左右，至溴酚蓝跑到凝胶底部，停止电泳，用染色液染色3h后，用脱色液脱色至条带清晰。在凝胶成像系统中记录实验结果。 3 试验结果（1） Kb为小分子与蛋白质结合的本征结合常数， cL,0和cp，0分别为4-O-AVM和BSA的初始摩尔浓度，n为1分子蛋白质所结合配体的分子数，它是蛋白质的配体结合位点数，x为结合率，可由下式计算得到： 式中△F和△Fmax分别为4-O-AVM与蛋白质结合达到平衡时所导致的蛋白质内源荧光强度的变化值和最大变化值，可由荧光滴定测出。固定BSA的初浓度，改变4-O-AVM的初始浓度，由上述公式，采用origin软件以△F/△Fmax对cL,0进行非线性最小方差拟合，即可获得Kb。 （2） Kd’为小分子与蛋白质结合的本征结合常数，P表示游离的BSA的浓度，R表示游离的4-O-AVM的浓度，PR表示BSA与4-O-AVM藕合物的