高二生物血红蛋白的提取和分离 案例.ppt

【尝试解答】　(1)④→①→②→③ (2)不要破坏凝胶面　使吸管管口沿管壁环绕移动 (3)完全进入凝胶层　红色的蛋白质　5 【解析】　加样品时应严格按要求进行操作，吸管应贴着管壁，管口沿着管壁环绕移动，还应注意不要破坏凝胶面。等样品完全进入到凝胶层时，才加入缓冲液进行洗脱。 课题3　 血红蛋白的提取和分离 课标领航 1．概述凝胶色谱法、电泳法等分离大分子的基本原理。 2．能根据凝胶色谱过程中的现象和结果，评价实验操作的过程是否规范，分析实验结果。 3．尝试对血液中血红蛋白的提取和分离，体验从复杂的体系中提取生物大分子的基本过程和方法。 【重点】　凝胶色谱法、电泳法基本原理。 【难点】　实验操作的过程及分析。 课题背景 为年老多病的人注射丙种 球蛋白，可以在一定程度上增强 其身体的抵抗力。在动物体内， 丙种球蛋白和许多蛋白质混合 在一起。要获得纯净的丙种球蛋 白制品，就必须进行提取和分离。 电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现了样品中各种分子的分离。 基础自主梳理 一、凝胶色谱法 1．依据2．概念3．原理 ★4．结合P64下面和P65上面，画出分离方法的表格 ★5 ．注意事项 二、缓冲溶液 1．作用2．配制3．意义 三、电泳 1．概念2．原理3．作用过程4．方法 核心要点突破 解读实验原理 1．蛋白质分子在凝胶中的运动情况分析 相对分子质量大 相对分子质量小 直径大小 大于凝胶颗粒空隙直径 小于凝胶颗粒空隙直径 运动方式 垂直向下运动 无规则的扩散运动 运动速度 较快 较慢 运动路程 较短 较长 洗脱次序 先从凝胶柱中洗脱出来 后从凝柱中洗脱出来 四、实验操作 原则：依据每一种蛋白质的来源和性质 血液、红细胞、血红蛋白的组成 1．样品处理： (1)红细胞的洗涤--------离心去除血清 (2)血红蛋白的释放--------蒸馏水涨破 (3)分离血红蛋白溶液--------离心处理 思考感悟? 1．洗涤红细胞时为什么不能用蒸馏水代替生理盐水？ 【提示】　生理盐水能保持红细胞的渗透压稳定而不至于破裂。在未洗净血浆中的杂质蛋白前，红细胞如果提前破裂，就可能使血红蛋白与杂质血浆蛋白混在一起，加大了分离的难度。 思考感悟? 2．在血红蛋白释放过程中，加入蒸馏水和甲苯的目的是什么？ 【提示】　(1)加入蒸馏水使红细胞吸水涨破。 (2)甲苯的作用主要是溶解细胞膜。细胞膜的主要成分为磷脂，易溶于甲苯等有机溶剂，加入甲苯能加速红细胞破裂并释放出血红蛋白。 2．粗分离：即透析 (1)方法 (2)目的：将样品中相对分子质量较小的杂质除去。 (3)原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子物质保留在袋内。 3．纯化：通过凝胶色谱柱将相对分子质量较大的杂质蛋白除去。操作如下： (1)凝胶色谱柱的制作 ①取长40 cm，内径为1.6 cm的玻璃管，两端需用砂纸磨平。 ②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好。 ③顶塞的制作：打孔→安装玻璃管。 ④组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。 ⑤安装其他附属结构。 特别提醒 底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。 (2)凝胶色谱柱的装填(本实验使用的凝胶是交联葡聚糖凝胶) ①固定：将色谱柱垂直固定在支架上 ? ②装填：将凝胶悬浮液一次性装填入色谱柱内 ? ③洗涤：用磷酸缓冲液充分洗涤平衡凝胶12 h 注意事项:不能有气泡存在；不能发生洗脱液流干露出凝胶颗粒的现象。 (3)样品的加入和洗脱 ①a.准备：加样前，打开流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与________平齐，关闭出口。 b．加样：用吸管小心地将1 mL透析后的样品加到色谱柱的顶端，注意不要破坏凝胶面。 c．加样后：打开下端出口，使样品渗入凝胶床内. ②洗脱：加入____________，打开下端出口，进行洗脱。 凝胶面 磷酸缓冲液 特别提醒 (1)滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。 (2)在蛋白质分离过程中，仔细观察红色区带在洗脱过程中的移动情况。如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功。 4．纯度鉴定：判断纯化的蛋白质是否达到要求。在鉴定的方法中，使用最多的是SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳。 五、操作提示 1．红细胞的洗涤 2．色谱柱填料的处理 3．凝胶色谱柱的装填 4．蛋白质的分离 六、结果分析与评价 【探规寻律】　对分离效果的判断 (1)若血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整地随洗脱液缓慢流出，则装填成功，分离操作正确。 (2)若血红蛋白的红色区带歪曲、散乱、变宽，则说明分离效果不好，装填不成功。